鄧松華 謝彪 彭天書 何永恒

〔摘要〕 目的 優(yōu)化天馬顆粒劑的最佳配方。方法 天馬顆粒劑的17味藥物按L20（217）正交表分為20組，并通過對20組大鼠灌胃獲取含藥血清。用5%、10%、20%含藥血清分別對人大腸癌細胞HCT8、HCT116、HT29、COLO320、SW480、SW620干預(yù)24、48、72 h，CCK-8法檢測細胞的吸光度，比較各組含藥血清對細胞的增殖抑制率。結(jié)果 經(jīng)直接分析和方差分析，原方中蜈蚣、全蝎、半邊蓮、黃柏、三棱、大黃、膽南星、海藻、黃芪、山藥均在大腸癌細胞的增殖抑制中發(fā)揮主要作用（均P<0.05，P<0.01），而其它藥物則無明顯作用（均P>0.05）。結(jié)論 根據(jù)正交設(shè)計優(yōu)選天馬顆粒劑的最佳配方為：蜈蚣、全蝎、半邊蓮、黃柏、三棱、大黃、膽南星、海藻、黃芪、山藥。

〔關(guān)鍵詞〕 天馬顆粒劑；正交設(shè)計；大腸癌；增殖抑制；優(yōu)化配方

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.009

Experimental Study of Formula Optimization of Tianma Granules by Orthogonal Design

DENG Songhua1， XIE Biao1， PENG Tianshu2， HE Yongheng2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China；

2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To optimize the best compatibility of Tianma granules. Methods The 17 Chinese medicines of Tianma granules were divided into 20 groups by L20 （217） orthogonal table. The serum containing drugs of rats by gavage were obtained. The optical density （OD） of colorectal cancer cell HCT8， HCT116， HT29， CoLo320， SW480， SW620， which were intervened at 24 h， 48 h， 72 h by 5%， 10%， 20% serum， were detected by CCK-8 methods. The inhibitory rate of 20 groups on cell proliferation was analyzed. Results The Wugong （centipede）， Quanxie （scorpion）， Banbianlian （lobelia）， Huangbai （cortex phellodendri）， Sanleng （burreed）， Dahuang （rhubarb）， bile arisaema， seaweed， milkvetch root， Shanyao （common yam rhizome） had inhibitory effect on the proliferation of colorectal cancer cell lines （P<0.05， P<0.01） in intuitive analysis and variance analysis， but the others had no significant effect on proliferation inhibition （all P>0.05）. Conclusion The best compatibility of Tianma granules is Wugong， Quanxie， Banbianlian， Huangbai， Sanleng， Dahuang， Dannanxing， Haizao， Huangqi， Shanyao.

〔Keywords〕 Tianma granules； orthogonal design； colorectal cancer； proliferation inhibition； optimized formulation

大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，是消化系中最常見的惡性腫瘤之一，其在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率位居第3位[1]，2010年結(jié)直腸癌在我國城市地區(qū)已成為第4位的常見惡性腫瘤[2]。由于受吸煙、體力活動過少、肥胖、食用紅肉與加工肉制品及過度飲酒等因素影響，大腸癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[3]。目前臨床上，手術(shù)雖然是治療大腸癌的主要方法，但術(shù)后單純放化療并不能完全有效的減少復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，并且復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其死亡的主要原因。近年來，大量的臨床研究與實驗研究均表明，中醫(yī)藥在大腸癌根治術(shù)后預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移﹑減毒增效﹑減輕疼痛以及提高生存質(zhì)量，延長生存期等方面發(fā)揮著非常重要的作用[4]。

天馬顆粒劑是由何永恒教授研發(fā)，在臨床應(yīng)用于大腸癌的治療取得了較好的臨床療效[5-7]，但該方由17味中藥組成，為了節(jié)約中藥資源，減少患者用藥費用，有必要對天馬顆粒劑原方進行拆方研究，以達到精減藥物組成、優(yōu)化方劑配伍的目的，并為該方的進一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)將應(yīng)用正交設(shè)計優(yōu)化配方的研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株及動物

人大腸癌細胞株HCT8、HCT116、HT29、COLO320、SW480、SW620購于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細胞培養(yǎng)中心。SD大鼠120只購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2013-0004，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半。室溫18～20 ℃，濕度為65%～70%，自由進食飲水。

1.2 藥品及試劑

天馬顆粒劑配方顆粒購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房（批號：（湘）衛(wèi)藥劑9706024）。按正交設(shè)計將各實驗組藥物用純凈水溶解后，冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

7Sea-Cell Counting Kit試劑盒（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司），0.25%胰蛋白酶（北京Solarbio公司），F(xiàn)BS南美胎牛血清（美國Serapro公司），RPMI1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），PBS磷酸鹽緩沖液（美國Hyclone公司）。

1.3 主要儀器

MK3型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；TDZ5-WS臺式低速離心機（湖南汀湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（德國Eppendorf公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 正交設(shè)計

天馬顆粒劑由蜈蚣、全蝎、重樓、半邊蓮、黃柏、三棱、莪術(shù)、大黃、膽南星、海藻、夏枯草、當(dāng)歸、黃芪、黨參、山藥、車前子、火麻仁等組成，分別由A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q代表。每味藥為一個因素，其代號隨機選定，均取“用藥”和“不用藥”兩個水平。實驗選用L20（217）正交表。因素與水平的安排見表1，正交設(shè)計分組見表2。

1.5 含藥血清制備

將120只大鼠隨機分為20組，每組6只，雌雄各半。標(biāo)準(zhǔn)食料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，予20組藥物溶解后灌胃給藥，給藥劑量相當(dāng)于成人日用量的5倍[8]，分早晚2次給藥，連續(xù)7 d，末次給藥2 h后麻醉，腹主動脈采血，室溫靜置2 h，1 500 r/min，離心15 min分離血清，同組血清混勻，56 ℃、30 min滅活補體，0.22 ？滋m過濾器除菌后分裝，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細胞培養(yǎng)

將人大腸癌細胞HCT8、HCT116、HT29、COLO320、SW480、SW620培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、100 ？滋g/mL的青霉素和鏈霉素的RPM1-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、相對濕度為95%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3天使用0.25%的胰蛋白酶消化傳代一次。取對數(shù)期細胞用于實驗。

1.7 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

每孔以含細胞數(shù)分別為2 000、4 000、8 000的細胞懸液100 ？滋L接種于96孔板，每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在避光條件下每孔加入CCK-8溶液10 ？滋L，輕敲培養(yǎng)板四周使其混勻，培養(yǎng)箱中分別孵育0.5、1、2、4 h后，酶標(biāo)儀上450 nm測定吸光度，使用Origin 6.0制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。選取吸光度值1.0時的細胞密度和加入CCK-8后的孵育時間用于后續(xù)實驗。

1.8 細胞增殖檢測

收集對數(shù)期的細胞，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定每種細胞的接種密度，將細胞懸液100 ？滋L接種于96孔板中，共20組，同時設(shè)對照組（只加細胞和培養(yǎng)基）和空白組（只加培養(yǎng)基不加細胞），每組設(shè)6個復(fù)孔。待細胞貼壁，將原培養(yǎng)基更換為濃度分別5%、10%、20%含藥血清的培養(yǎng)基100 ？滋L，不加細胞組和空白對照組均更換為等體積的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。加入CCK-8溶液10 ？滋L同“1.7”，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定每種細胞繼續(xù)孵育時間，在培養(yǎng)箱中孵育后，酶標(biāo)儀上450 nm測定吸光度值（A）。實驗重復(fù)3次。計算細胞增殖抑制率（IR）：IR%=[1-（干預(yù)組A-空白組A）]/（對照組A-空白組A）×100。每組選取最佳細胞增殖抑制率用于統(tǒng)計分析實驗結(jié)果。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計分析，采用正交設(shè)計方差分析。以P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直觀分析

經(jīng)20組含藥血清干預(yù)后，用CCK-8法檢測人大腸癌細胞株HCT8、HCT116、HT29、COLO320、SW480、SW620的吸光度值，經(jīng)過計算所得到的細胞抑制率（IR）。根據(jù)表2可知，天馬顆粒劑的最優(yōu)配方為：A1、B1、C2、D1、E1、F1、G2、H1、I1、J1、K2、L2、M1、N2、O1、P2、Q2，因水平1為原劑量，水平2為不用，故最優(yōu)配方為：A1、B1、D1、E1、F1、H1、I1、J1、M1、O1。見表2。

2.2 方差分析

經(jīng)正交設(shè)計方差分析，天馬顆粒劑中各藥物在抑制大腸癌細胞增殖中的主次分別為：A、F、J、E、I、D、B、M、O、H、Q、C、G、L、N、K、P。蜈蚣、全蝎、黃柏、三棱、大黃、膽南星、海藻、半邊蓮、黃芪、山藥抑制大腸癌細胞的增殖比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；而重樓、莪術(shù)、夏枯草、當(dāng)歸、黨參、車前子、火麻仁對大腸癌細胞的增殖抑制作用比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。見表3。

3 討論

何永恒教授通過總結(jié)先秦到民國時期關(guān)于“大腸癌”病因病機、辨證體系和防治的中醫(yī)相關(guān)記載[9-10]，將該病的病因病機歸納為“毒、瘀、痰、虛”，根據(jù)古代名方化痞膏、黃芪益損湯和內(nèi)消瘰疬丸化裁，而研發(fā)出天馬顆粒劑。經(jīng)臨床多年應(yīng)用，該方治療中晚期結(jié)大腸癌及抑制大腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移均取得了較好的臨床療效[5-7]。且體外實驗表明，天馬顆粒劑可顯著抑制大腸癌細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡[11]。第一代方由19味藥物組成，即蜈蚣、全蝎、馬錢子、重樓、半邊蓮、黃柏、大黃、三棱、莪術(shù)、膽南星、海藻、夏枯草、黃芪、黨參、當(dāng)歸、石斛、火麻仁、車前子、山藥，經(jīng)過近20年的臨床應(yīng)用、研究和總結(jié)，減去原方中馬錢子和石斛后，配方精減至17味中藥，即本實驗所使用的配方。本實驗旨在精減方藥組成，優(yōu)化天馬顆粒劑的處方配伍。

正交試驗設(shè)計是使用正交表來安排試驗的方法，具有“均勻分散，齊整可比”的特點，是一種高效率、快速、經(jīng)濟的試驗設(shè)計方法。在中藥復(fù)方研究中，應(yīng)用正交設(shè)計有利于分析中藥復(fù)方配伍的主次關(guān)系，發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方最佳配伍，指導(dǎo)臨床合理用藥[12]。故本實驗采用正交設(shè)計，探討優(yōu)化天馬顆粒劑原方中藥物的最佳配伍。本實驗中所采用的CCK-8法，通過檢測水溶性四唑鹽被活細胞線粒體內(nèi)脫氫酶氧化還原后生產(chǎn)的甲臜間接反映活細胞的數(shù)量，生成的甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。本法具有靈敏度高，重復(fù)性較好，毒性低，操作簡單，檢測時間短的優(yōu)點，已常規(guī)應(yīng)用于生物活性因子檢測、抗腫瘤藥物篩選、腫瘤藥敏試驗、細胞增殖測定及細胞毒性檢測等[13-17]。本實驗直觀分析結(jié)果表明天馬顆粒劑作用于大腸癌細胞的優(yōu)化處方配伍為：蜈蚣2 g，全蝎3 g，半邊蓮15 g，黃柏6 g，三棱10 g，膽南星3 g，海藻10 g，黃芪20 g，山藥20 g，大黃6 g。方差分析結(jié)果顯示，天馬顆粒劑原方中17味中藥的主次順序為：蜈蚣>三棱>海藻>黃柏>膽南星>半邊蓮>全蝎>黃芪>山藥>大黃>火麻仁>重樓>莪術(shù)>當(dāng)歸>黨參>夏枯草>車前子。天馬顆粒劑原方對大腸細胞增殖抑制作用主要與蜈蚣、三棱、海藻、黃柏、膽南星、半邊蓮、全蝎、黃芪、山藥、大黃等有關(guān)（均P<0.05），與重樓、莪術(shù)、夏枯草、當(dāng)歸、黨參、車前子、火麻仁等藥無關(guān)（均P>0.05）。

天馬顆粒劑優(yōu)化方中蜈松、全蝎攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛，以毒攻毒為君藥；半邊蓮味辛，性平，功效清熱解毒、利水消腫，黃柏味苦，性寒，具有清熱燥濕、解毒療瘡之效。二者合用清熱解毒，共為臣藥；三棱破血消積止痛，膽南星清熱化痰，海藻軟堅散結(jié)，黃芪、山藥益氣養(yǎng)陰以扶正，同時防攻伐之藥耗傷正氣，共為佐藥；大黃瀉下通腑以助大腸之傳導(dǎo)，以通降為補，引邪外出，且兼活血化瘀之妙，為使藥。全方具拔癌毒、消結(jié)腫、通經(jīng)絡(luò)、止疼痛之效。全方以攻毒祛邪為主，兼以扶正培本，攻補兼施，從而達到“祛邪不傷正，扶正不留邪”的目的，切合大腸癌“毒、瘀、痰、虛”病因病機特點。

本實驗通正交設(shè)計優(yōu)化了天馬顆粒劑配方組成，尚未對該優(yōu)化處方進行更深一步研究，下階段擬在分子水平和體內(nèi)外實驗中對大腸癌細胞增殖和凋亡影響及體內(nèi)的抑瘤效果進一步探索，為天馬顆粒劑優(yōu)化方治療大腸癌提供相關(guān)實驗依據(jù)。

參考文獻：

[1] SIEGEL R， DESANTIS C， JEMAL A. Colorectal cancer statistics， 2014[J]. CA Cancer J Clin， 2014， 64（2）：104-117.

[2] 陳萬青，張思維，曾紅梅，等.中國2010年惡性腫瘤發(fā)病與死亡[J].中國腫瘤，2014，23（1）：1-10.

[3] JEMAL A， BRAY F， CENTER M M， et al， Forman D. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin， 2011，61（2）：69-90.

[4] 李克桑，李 琦.中醫(yī)藥防治大腸癌臨床研究進展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2012，39（5）：953-955.

[5] 黃國棟，黃媛華，黃 敏，等.天馬顆粒劑配合希羅達治療中晚期大腸癌的臨床研究[J].中藥材，2009，32（5）：831-832.

[6] 黃晨容，何永恒.天馬顆粒劑對延長大腸癌根治術(shù)后生存期的臨床研究[J].同濟大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2004，25（1）：58-60.

[7] 彭天書，謝 彪，聶 甜，等.天馬顆粒劑在抑制結(jié)直腸癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)中的臨床效果[J].中藥藥理與臨床，2016，32（3）：191-193.

[8] 丁 寧，楊宇飛，劉羿男，等.健脾活血解毒法拆方含藥血清對人大腸癌細胞HCT-116細胞的增殖抑制作用及其機制研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（11）：272-275.

[9] 何永恒，成立祥，劉 麗，等.大腸癌的中醫(yī)藥防治發(fā)展脈絡(luò)初探（一）[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，16（3）：1-3.

[10] 何永恒，成立祥，劉 麗，等.大腸癌的中醫(yī)藥防治發(fā)展脈絡(luò)初探（二）[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，16（6）：4-8.

[11] 彭天書.天馬顆粒劑的拆方研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[12] 楊清華，孫 博，郭艷艷，等.應(yīng)用正交設(shè)計法篩選天麻鉤藤飲優(yōu)化處方研究[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，19（7）：410-412.

[13] 張大偉，邢 雪，鄧乃梅，等.人肝癌細胞培養(yǎng)中CCK-8法與BrdU-ELISA法檢測細胞增殖的比較[J].臨床普外科電子雜志，2013，1（4）：4-7.

[14] 高丕堯，龍軍先，甘嘉亮，等.CCK-8法與Alamar blue法對RKO細胞株增殖活力測試條件的對比分析[J].華西藥學(xué)雜志，2015，30（1）：38-41.

[15] 陳 沖，焦 寧，靖景艷，等.臺盼藍拒染法、MTT法、CCK-8法在研究As2O3細胞毒性作用中的意義[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10（12）：24-26.

[16] MA L， SONG B， JIN H， et al. Cinobufacini induced MDA-MB-231 cell apoptosis-associated cell cycle arrest and cytoskeleton function[J]. Bioorg Med Chem Lett， 2012，22（3）：1459-1463.

[17] KIM H， LIM H Y. Novel EGFR-TK inhibitor EKB-569 inhibits hepatocellular carcinoma cell proliferation by AKT and MAPK pathways[J]. J Korean Med Sci， 2011，26（12）：1563-1568.