李軍山 聶麗建

摘要：為了建立同時(shí)測(cè)定仙鶴草配方顆粒中蘆丁、槲皮苷、木犀草素含量的有效方法，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、提取溶劑及提取方式等因素進(jìn)行考察，最終確定了采用HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定仙鶴草配方顆粒中的3種成分，采用InertSustain AQ-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.5%醋酸為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為35 ℃。結(jié)果表明，蘆丁、槲皮苷、木犀草素分別在0.216～5.410，0.185～4.635，0.147～3.680 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2分別為0.999 5，0.999 6和0.999 7，平均回收率（n=6）分別為101.5%，1001%和99.5%。該方法快速準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可用于仙鶴草配方顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：色譜分析；仙鶴草配方顆粒；蘆丁；槲皮苷；木犀草素；HPLC

中圖分類號(hào)：R2841文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Adoi： 10.7535/hbgykj.2018yx04011

仙鶴草（Agrimonia pilosa Ledeb）始載于《本草圖經(jīng)》，為薔薇科多年生草本植物龍芽草的全草[1]，夏、秋二季莖葉茂盛時(shí)采割，常用名為脫力草、龍芽草、石打穿、狼牙草等，主產(chǎn)于浙江、江蘇、湖北，銷往全國(guó)并出口；此外，安徽、遼寧、福建、廣東、河北、山東、湖南、云南等地亦產(chǎn)。仙鶴草性平，味苦、澀，具有收斂止血、截瘧、止痢、解毒、補(bǔ)虛等功效，用于咯血、吐血、崩漏下血、瘧疾、血痢、癰腫瘡毒、陰癢帶下、脫力勞傷等癥狀的治療[2-8]。

目前，對(duì)于仙鶴草的研究方法不一，有薄層掃描法、紅外光譜和電泳法等，各方法均有優(yōu)缺點(diǎn)。GU等[9]利用薄層色譜法測(cè)定仙鶴草成分，雖時(shí)間較短，但操作過(guò)程中受環(huán)境的影響較大，測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性、重復(fù)性較差；李強(qiáng)等[10]利用紅外光譜法對(duì)仙鶴草原藥材及其提取物進(jìn)行了分析與鑒定，但并未對(duì)其中具體成分的含量進(jìn)行測(cè)定；還有研究人員分別利用高效液相色譜法-二極管陣列檢測(cè)-電噴霧離子化-串聯(lián)質(zhì)譜法和高速逆流色譜法對(duì)仙鶴草中的多種活性成分進(jìn)行了純化分析[11-12]，但利用HPLC法同時(shí)測(cè)定仙鶴草配方顆粒中多種成分的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-DAD法，同時(shí)測(cè)定仙鶴草配方顆粒中蘆丁、槲皮苷、木犀草素3種成分的含量，以提高仙鶴草配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[13-16]。

1主要儀器與試藥

日本島津LC-20AT、Agilent1260型高效液相色譜儀。

仙鶴草配方顆粒（神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，批號(hào)分別為15100211，15122111，15122611，16030411，16031411，16032711）；蘆丁（批號(hào)為100080-201610）、槲皮苷（批號(hào)為111538-201606）、木犀草素（批號(hào)為111520-201605）對(duì)照品，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，天津科密歐試劑有限公司提供）；其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：InertSustain AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為35 ℃，流速為0.8 mL/min，流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

2.2溶液的配制

2.2.1對(duì)照品溶液

精密稱取蘆丁對(duì)照品10.73 mg，置于50 mL量瓶中；精密稱取槲皮苷對(duì)照品9.27 mg，置于50 mL

量瓶中；精密稱取木犀草素對(duì)照品14.72 mg，置于100 mL 量瓶中。加入80%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品貯備液。精密量取5 mL，置于同一50 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，即得。

2.2.2供試品溶液[17-19]

取仙鶴草配方顆粒，研細(xì)，稱取約1.00 g，置于具塞錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，精密稱定，超聲30 min，放冷后用80%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.3專屬性試驗(yàn)

取上述供試品、對(duì)照品和陰性樣品溶液，按照“21”項(xiàng)條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。各成分的理論塔板數(shù)（n=5.54（t/w1/2）2，n為理論塔板數(shù)，t為相對(duì)保留時(shí)間，w1/2為半峰寬）及分離度（R=2（t2-t1）/（w1+w2），R為分離度，t1和w1分別為相鄰色譜峰的前一峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰寬，t2和w2分別為相鄰色譜峰的后一峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰寬）見(jiàn)表2。

2.4線性關(guān)系考察

取對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣1，5，10，15，20，25 μL，以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得到回歸方程（n=6）如下。

蘆?。簓=1 051.1x-2 027.9（R2=0.999 5）；

槲皮苷：y=904.91x-4 160.9（R2=0.999 6）；

木犀草素：y=4 646x-1 116.8（R2=0.999 7）。

結(jié)果表明：蘆丁、槲皮苷、木犀草素在0.216～5410，0.185～4.635，0.147～3.680 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)定蘆丁、槲皮苷、木犀草素的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，于0，3，6，12，18，24 h 進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定蘆丁、槲皮苷、木犀草素的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)樣品6份（批號(hào)為14100211），每份0.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定蘆丁、槲皮苷和木犀草素的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可以看出，該方法的重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

稱取同一批仙鶴草配方顆粒，研細(xì)，按“2.2.2”項(xiàng)方法各稱取約1.00 g，平行制備3份樣品，測(cè)定各成分含量；再稱取3組9份仙鶴草配方顆粒樣品，各加入一定量的對(duì)照品，分別進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果顯示，蘆丁、槲皮苷和木犀草素的平均回收率分別為101.5%，100.1%和99.5%。

2.9耐用性試驗(yàn)

用依利特Sinochrom ODS-BP （250 mm×4.6 mm，5 μm） 和Thermo Sciences BETASIL C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm） 色譜柱在2臺(tái)高效液相色譜儀（島津LC-20AT和Agilent1260） 上進(jìn)行耐用性試驗(yàn)考察，測(cè)定其峰面積，結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明，2個(gè)廠家的液相色譜儀和2種色譜柱均可滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.10樣品含量測(cè)定

取6批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。

2.11檢測(cè)限與定量限

取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品貯備液，逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣，以色譜峰峰高為基線噪音3倍進(jìn)行計(jì)算，蘆丁、槲皮苷和木犀草素的檢測(cè)限分別為1.460，0.440和1064 ng；以色譜峰峰高為基線噪音10倍進(jìn)行計(jì)算，定量限分別為4.380，1.320和3.192 ng。

3討論

3.1流動(dòng)相的選擇

蘆丁、槲皮苷和木犀草素的檢測(cè)流動(dòng)相大多采用乙腈-磷酸、醋酸溶液或乙腈-水，也有用甲醇-磷酸溶液、甲醇-冰醋酸或甲醇-水溶液。采用甲醇時(shí)，各色譜峰的分離度及峰型對(duì)稱情況較差。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了乙腈-磷酸水溶液及乙腈-不同濃度的醋酸水溶液，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相洗脫時(shí)，基線不穩(wěn)且槲皮苷的分離度較低；以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰個(gè)數(shù)減少；以乙腈-0.5%醋酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，4種被測(cè)成分都能得到很好的分離。故本實(shí)驗(yàn)以乙腈-0.5%醋酸水溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式，使3種成分均有合適的保留時(shí)間和較高的分離度。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析的全波長(zhǎng)掃描圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蘆丁在255 nm和354 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，槲皮苷在255 nm和349 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，木犀草素在252 nm和348 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，3種成分的全波長(zhǎng)掃描圖見(jiàn)圖2。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，色譜圖基線平穩(wěn)，雜峰少，各成分均有較高響應(yīng)，在上述實(shí)驗(yàn)條件下定量準(zhǔn)確，回收率較高。

3.3提取方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了超聲提取、索氏提取、回流提取等方式，研究了回流時(shí)間和超聲時(shí)間。結(jié)果顯示，3種提取方法差異較小，超聲時(shí)間小于20 min時(shí)測(cè)定結(jié)果偏低，而在30 min以上時(shí)較為穩(wěn)定。因此，選擇超聲30 min作為提取方法。

3.4提取溶劑的選擇

用純甲醇、乙醇、水及不同比例的甲醇溶液作為提取溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)純甲醇對(duì)極性較大的成分提取效果差，乙醇對(duì)各種成分的提取效果均不佳，水對(duì)極性較小成分的提取效果差，40 min后出峰成分提取效率極低，20%的甲醇對(duì)40 min后出峰的成分提取效果亦不佳。對(duì)比分析50%和80%甲醇作為提取溶劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)80%甲醇提取的蘆丁、槲皮苷、木犀草素的峰型及分離度最好、基線最優(yōu)。因此，最終確定以80%的甲醇作為提取溶劑。

4結(jié)語(yǔ)

利用HPLC法同時(shí)測(cè)定仙鶴草配方顆粒中的多種成分目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、提取溶劑及提取方式等進(jìn)行考察，最終確定了采用HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定仙鶴草配方顆粒中的3種成分，以乙腈-0.5%醋酸為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為35 ℃。結(jié)果表明，蘆丁、槲皮苷、木犀草素分別在0.216～5410，0.185～4.635，0.147～3.680 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2分別為0.999 5，0.999 6和0999 7，平均回收率（n=6）分別為101.5%，1001%和99.5%。該方法快速準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可用于仙鶴草配方顆粒的質(zhì)量控制。

仙鶴草中含有蘆丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素等多種黃酮類成分，此類成分具有抗心律失常、抑制乙酰膽堿酯酶、降糖等多種藥理作用。本文僅對(duì)3種成分進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，未來(lái)應(yīng)繼續(xù)深入研究仙鶴草配方顆粒中的其他黃酮類成分，以保證臨床療效。

參考文獻(xiàn)/References：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：102-103.

[2]王云，孟立霞，薛白，等.黔東南產(chǎn)仙鶴草的原花青素含量和抗氧化能力測(cè)定[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，46（1）：47-50.

WANG Yun，MENG Lixia，XUE Bai，et al.Determination on the procyanidin content and antioxidation in Agrimonia pilosa Ledeb from Qiandongnan[J].Journal of Shandong Agricultural University（Natural Science Edition），2015，46（1）：47-50.

[3]張鳳，張謙.仙鶴草治療竇性心動(dòng)過(guò)緩[J].中國(guó)民間療法，2013，21（5）：34.

[4]巴曉雨，何永志，路芳，等.仙鶴草研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（5）：258-261.

BA Xiaoyu，HE Yongzhi，LU Fang，et al. Research progress of Agrimonia pilosa Ledeb[J].Journal of Liaoning University of TCM，2011，13（5）：258-261.

[5]蒙衍強(qiáng)，唐獻(xiàn)蘭，黃健軍，等.閃提法對(duì)仙鶴草止血鎮(zhèn)痛作用的影響[J].中成藥，2013，35（7）：1560-1562.

[6]王寶慶，金哲雄.仙鶴草的化學(xué)成分及抗氧化研究進(jìn)展[J].北方園藝，2011，35（10）：167-169.

WANG Baoqing，JIN Zhexiong. Research progress on constituents and antioxidant in Agrimonia pilosa Ledeb[J].Northern Horticulture，2011，35（10）：167-169.

[7]洪閣，戴永紅，劉培勛，等.仙鶴草化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2008，8（5）：362-366.

HONG Ge，DAI Yonghong，LIU Peixun，et al. Advances in research on chemical constituents and pharmacological activities of Agrimonia pilosa[J].Journal of Pharmaceutical Services and Research， 2008，8（5）：362-366.

[8]KIM J J，JIANG J，SHIM D W.Auti-iuflammatory and auti-allergic effects of Agrimonia pilosa Ledeb extract on murine cell lines and OVA-iuduced airway iuflammation[J].Journal of Ethnopharmacology，2012，140（2）：213-221.

[9]GU X Q，LI H Q，QI B L.TLC densitometric determination of agrimophol in the buds of Agrimoniar pilosa[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，1980，6（8）： 346-348.

[10]李強(qiáng)，張榮強(qiáng).仙鶴草原藥材及提取物的紅外光譜的分析與鑒定[J].北方藥學(xué)，2011，8（6）： 4-5.

[11]JIANG Qinghua， MA Jianghao，WANG Ying. Simulraneous clererminarion of nine major consrituems in Agrimonia pilosa Ledeb by HPLC-DAD-ESI-MS MS [J].Analytical Methods，2014，6（12）：4373-4379.

[12]WANG Yan， LIU Mozhen，ZHENG Lingli. Preparative purification of five bioactive compoueuts from Agrimonia pilosa Ledeb by high-speed counter-current chromatography[J].Journal of Separation Science，2012，35（15）：1977-1984.

[13]路芳，巴曉雨，何永志.仙鶴草的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2012，43（5）：851-855.

LU Fang，BA Xiaoyu，HE Yongzhi.Chemical constituents of Agrimoniae Herba[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，2012，43（5）：851-855.

[14]劉位杰，梁敬鈺，孫建博，等.仙鶴草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2016，28（2）：1-7.

LIU Weijie，LIANG Jingyu，SUN Jianbo，et al.Research progress of the Agrimonia pilosa Ledeb on the chemical constituents and pharmacological activity[J]. Strait Pharmaceutical Journal，2016，28（2）：1-7.

[15]高意，周光明，陳軍華，等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定仙鶴草中6種黃酮[J].食品科學(xué)，2015，36（18）：93-96.

GAO Yi，ZHOU Guangming，CHEN Junhua，et al. Determination of six flavonoids in Agrimonia pilosa Ledeb by HPLC[J].Journal of Food Science，2015，36（18）：93-96.

[16]趙艷霞，陳芳，鄧雁如.HPLC測(cè)定仙鶴草中山奈酚-3-O-（6-p-香豆?；?β-D-吡喃葡萄糖苷含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（3）：644-646.

ZHAO Yanxia，CHEN Fang，DENG Yanru. Determination of Tiliroside in Agrimoniae Herba by HPLC[J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine，2014，32（3）：644-646.

[17]孫奕，王穎，譚碧林，等.近緣植物仙鶴草、委陵菜和翻白草中6種黃酮類化合物含量的比較[J].中藥材，2016，39（5）：991-995.

SUN Yi，WANG Ying，TAN Bilin，et al. Comparison of six flavonoid components of closely-related plants Agrimonia pilosa，Potentilla chinensis and Potentilla discolor[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials，2016，39（5）：991-995.

[18]哈婧，王嬌嬌，趙帆帆，等.石韋配方顆粒HPLC-DAD特征圖譜研究[J].河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，38（1）：39-45.

HA Jing，WANG Jiaojiao，ZHAO Fanfan，et al. Study of HPLC-DAD characteristic chromatogram of Pyrrosia leaf formula granules[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2017，38（1）：39-45.

[19]劉磊，王慧.RP-HPLC法測(cè)定仙鶴草藥材中槲皮素的含量[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30（11）：1369-1370.