陳靜　童桂香　黃鸞玉　黎小正　吳祥慶　黃國秋　謝宗升　熊建華　譚紅連　韋信賢

摘要：【目的】建立一種能擴增dnaJ基因全長的PCR檢測方法，為弧菌的快速篩查及種類鑒定提供技術支持。【方法】以弧菌dnaJ基因為靶基因，在其首尾的保守區(qū)域設計一對簡并引物，經(jīng)優(yōu)化退火溫度和引物濃度，建立能擴增弧菌接近全長dnaJ基因的PCR檢測方法，并通過特異性試驗、靈敏度試驗和臨床應用評價等驗證其適用性?！窘Y果】優(yōu)化后的PCR反應體系50.0 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各2.0 μL，DNA模板5.0 μL，滅菌水補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。該PCR檢測方法對副溶血弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、霍亂弧菌和棲黑?；【?種弧菌屬細菌具有很強的特異性，對弧菌的最低檢出限為102 CFU/mL。應用建立的PCR檢測方法對51株分離自海水樣品的弧菌和32株分離自對蝦樣品的弧菌進行檢測，結果顯示全部為陽性，其中，海水樣品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和棲黑?；【瑢ξr樣品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌；經(jīng)測序及同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，種間菌株的dnaJ基因序列相似度為79.5%～92.8%，種內(nèi)菌株間的dnaJ基因序列相似度為98.2%～99.9%?！窘Y論】基于dnaJ基因建立的弧菌PCR檢測方法能擴增出弧菌接近全長dnaJ基因，具有快速便捷、靈敏準確、適應性好等優(yōu)點，結合測序技術，可為弧菌快速篩查及種類鑒定提供更全面和更準確的技術手段。

關鍵詞： 弧菌；dnaJ基因；PCR檢測；鑒定

中圖分類號： S941.42 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）06-1228-07

Abstract：【Objective】A PCR detection method that could amplifiy full length of dnaJ gene was developed in order to provide technical support for rapid detection and identification of Vibrio species. 【Method】Taking dnaJ gene of Vibrio as target gene， a pair of degenerate primers were designed on the beginning and the end conserved domain. Then a PCR detection method that could amplify almost full length dnaJ gene of Vibrios was developed following optimization of annea-ling temperature and primers concentrations. The specificity and sensitivity tests， detection for clinical samples were carried out to evaluate the applicability of this method. 【Result】The optimized PCR ampli?cation reactions 50.0 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL included 2.0 μL for upstream primer and downstream primer， 5.0 μL of the template and nuclease free water to a ?nal volume of 50.0 μL. PCR ampli?cation was carried out as follows： 3 min initial denatu-ration step at 94 ℃， followed by 35 cycles of 94 ℃ for 10 s， 55 ℃ for 15 s， and 72 ℃ for 15 s， with a ?nal extension step of 5 s at 72 ℃. The method showed strong specificity for V. parahaemolyticus， V. harveyi， V. vulnificus， V. fluvialis， V. alginolyticus， V. mimicus， V. cholerae and V. ponticus， and its detection sensitivity can reach 102 CFU/mL. Detected by the PCR method established， the results of 51 Vibrios strains isolated from seawater samples and 32 Vibrios strains isolated from Penaeus vannamei samples were positive. The 51 Vibrios strains isolated from seawater samples contained strains V. parahaemolyticus， V. harveyi， V. vulnificus， V. fluvialis， V. alginolyticus and V. Ponticus； and 32 Vibrios strains isolated from P. vannamei samples contained V. parahaemolyticus， V. harveyi， V. vulnificus， V. fluvialis and V. alginolyticus. Sequencing analysis and homology alignment of above 83 Vibrios showed that interspecific dnaJ gene sequence similarities reached 79.5%-92.8%， and intraspecies dnaJ gene sequence similarities reached 98.2%-99.9%. 【Conclusion】The method developed base on dnaJ gene in this study can amplify almost full length dnaJ gene of Vibrios， and is fast， convenient， sensitive， accurate and adaptable.It can provide all-around and rapid detection of Vibrios and identification of Vibrio species along with sequencing analysis.

Key words： Vibrios； dnaJ gene； PCR detection； identification

0 引言

【研究意義】弧菌屬（Vibrio spp.）是一群菌體短小、彎曲成弧狀或逗點狀的革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界中，以海水中最多，是一種常見的條件致病菌，在水體富營養(yǎng)化的養(yǎng)殖環(huán)境下可迅速繁殖，引起養(yǎng)殖動物暴發(fā)弧菌病。據(jù)水產(chǎn)病害監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，弧菌病已成為海水養(yǎng)殖中最常見、流行廣、危害大的一類疾?。ê鷫羧A，2015）。此外，部分弧菌感染人體后可引起腹瀉、創(chuàng)傷感染或中耳炎等（Li et al.，2009），近年來因致病性弧菌引發(fā)的衛(wèi)生健康事件時有報道（鄭建成等，2015；陳小敏等，2017）。目前，弧菌檢測主要采用傳統(tǒng)的生化鑒定，需經(jīng)增菌、分離純化、染色、生化鑒定等步驟，操作過程煩瑣，檢測周期長（東秀珠和蔡妙英，2001），且不適應大量樣本分析及快速檢測的需求。因此，開展弧菌快速檢測及種間鑒定技術研究對有效控制弧菌病的發(fā)生與流行、保障海水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展及公共衛(wèi)生安全均具有重要意義。【前人研究進展】在細菌分類學上，16S rRNA基因和管家基因序列分析均可用于細菌種屬的分子鑒定（Stackebrandt et al.，2002），但由于弧菌存在16S rRNA基因多拷貝現(xiàn)象，導致上述兩種方法在弧菌鑒定上的應用存在局限性和不確定性（閻永偉，2013）。管家基因hsp60（Kwok et al.，2002）、gapA（Nishiguchi and Nair，2003）、gyrB（Le Roux et al.，2004）、recA、rpoA和pyrH（Thompson et al.，2005）也曾應用于弧菌種類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究，其中，hsp60、gapA和gyrB基因僅能鑒定少數(shù)種類，而recA、rpoA和pyrH被認為是弧菌種類鑒定強有力的分子標記（Thompson et al.，2004），但利用這些管家基因仍無法有效區(qū)分海神弧菌（V. neptunius）與溶珊瑚弧菌（V. coralliilyticus）、鰻弧菌（V. anguillarum）與奧氏弧菌（V. ordalii），即不能對所有弧菌進行鑒定。dnaJ基因長約1150 bp，編碼熱休克蛋白40（HSP40），在不同細菌種內(nèi)高度保守（Bustard and Gupta，1997；肖代雯等，2012），已被證實非常適用于分支桿菌屬（Mycobacterium）、軍團菌屬（Legionella）和鏈球菌屬（Streptococcus）的種間鑒定（Liu et al.，2003；Itoh et al.，2006）。dnaJ基因序列分析在區(qū)分和鑒定弧菌近緣種方面也表現(xiàn)出比16S rRNA、recA、rpoA和hsp60基因更明顯的優(yōu)勢（Nhung et al.，2007）。【本研究切入點】dnaJ基因可作為弧菌種類鑒定的遺傳進化分子標記，但目前僅擴增dnaJ基因的558 bp片段用于序列分析，以致于部分弧菌仍無法準確鑒定。因此，若能建立擴增弧菌dnaJ基因全長的PCR方法，必將有助于其種類的準確鑒定?！緮M解決的關鍵問題】以弧菌dnaJ基因為靶基因，優(yōu)化引物設計和PCR反應條件，擬建立一種能擴增dnaJ基因全長的PCR檢測方法，為弧菌的快速篩查及種類鑒定提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

副溶血性弧菌ATCC 17802、哈氏弧菌ATCC 33868、創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562、河流弧菌ATCC 33809、擬態(tài)弧菌ATCC 33653、霍亂弧菌NH87-21、沙門氏菌ATCC 14028、志賀氏菌CMCC（B）51252、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、單增李斯特氏菌CVCC 1598和大腸埃希氏菌CMCC 44568等購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，溶藻弧菌ATCC 17749購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，副溶血性弧菌VP-FCG151118、哈氏弧菌VH-QZ160809、溶藻弧菌VA-QZ160809、創(chuàng)傷弧菌VV-BH160905、棲黑?；【鶹p-BH160905、河流弧菌VF-FCG170910、致病性嗜水氣單胞菌AH-TE090214、溫和氣單胞菌AS-NN090617、肺炎克雷伯菌KP-PX120222和無乳鏈球菌SA-NN130813由廣西水產(chǎn)科學研究院水生動物疫病監(jiān)控中心實驗室保存提供；營養(yǎng)肉湯、3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）、血瓊脂培養(yǎng)基、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖（TCBS）瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋技術有限責任公司；2×F8 FastLong PCR MasterMix（含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液）、細菌基因組DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。檢測樣品包括32份海水樣品（20份采自廣西漁業(yè)環(huán)境常規(guī)監(jiān)測海域，12份采自南美白對蝦養(yǎng)殖池塘）和36份對蝦樣品（采自廣西沿海對蝦養(yǎng)殖場）。

1. 2 引物設計

從GenBank下載已公布的10種常見弧菌dnaJ基因全序列，采用MegAlign中的ClustalW進行同源性比對分析，以Primer Premier 5.0篩選結合Oligo 6.0評價，在dnaJ基因序列首尾的保守區(qū)域設計一對可擴增接近全長dnaJ基因的簡并引物（上游引物XX-VF1：5'-GTGATTTTTACGAAGTATTAGGC-3'，下游引物XX-VR1：5'-GGTTAAATCRTCRAARAACTT-3'），預期片段大小1130 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 菌種復蘇及DNA提取

取凍存的各弧菌屬菌株劃線接種于TSA培養(yǎng)基上，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h后挑選單菌落接種于TSB培養(yǎng)基，（36±1）℃繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h。非弧菌屬供試菌株則劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h后挑選單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，（36±1）℃繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h。取上述菌液1.0～3.0 mL，10000 r/min離心1 min，棄上清液，收集菌體，按細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取DNA。

1. 4 PCR反應條件優(yōu)化

退火溫度優(yōu)化：參考引物合成時計算得到的Tm（上、下游引物分別為54.2和53.7 ℃），在50～60 ℃范圍內(nèi)設計退火溫度梯度進行PCR擴增，篩選出最適退火溫度。引物濃度優(yōu)化：在最適退火溫度下，將引物設為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 μmol/L等10個濃度梯度進行PCR擴增，篩選出擴增效率高且無非特異性條帶的最適引物濃度。

1. 5 特異性試驗

采用優(yōu)化后的PCR反應條件對弧菌屬菌株及非弧菌屬菌株進行PCR擴增檢測，觀察其特異性。

1. 6 靈敏度試驗

以副溶血弧菌為例，取純菌種接種于APW培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至對數(shù)期；經(jīng)TCBS平板計數(shù)確定原始濃度后用生理鹽水進行10倍梯度稀釋（108～10 CFU/mL），各梯度取1.0 mL菌液提取DNA并進行PCR擴增，以檢測方法的靈敏度。

1. 7 臨床應用評價

參照GB 4789.7—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》對海水樣品和對蝦樣品進行增菌培養(yǎng)，取25.0 mL海水樣品或對蝦樣品25.0 g（成蝦取肝胰腺和鰓/蝦苗取整蝦，勻漿或以剪刀盡量剪碎），加入225.0 mL APW，（36±1）℃培養(yǎng)8～18 h后以接種環(huán)沾取一環(huán)增菌液，劃線接種于TCBS培養(yǎng)基上，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h；挑取優(yōu)勢菌落劃線接種于TSA培養(yǎng)基上，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h；挑選純培養(yǎng)的單個菌落接種于TSB培養(yǎng)基，（36±1）℃繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h；取1.0～3.0 mL菌液按1.3的方法提取DNA并進行PCR擴增，陽性擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在GenBank中進行BLAST同源比對分析，確定菌種。同時，利用LaserGene中的MegAlign對上述所獲弧菌序列進行同源性分析比對，采用MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，評價dnaJ基因作為弧菌種類鑒定遺傳進化標記的適用性。

2 結果與分析

2. 1 PCR擴增反應條件

退火溫度在50～60 ℃范圍內(nèi)均能擴增出對應的目的條帶（圖1），當退火溫度高于57.2 ℃（泳道9～12）時，隨退火溫度的升高其擴增效果有所下降；退火溫度為53.1～56.6 ℃（泳道4～8）時目的基因的擴增效率高且差異不明顯，故選取55 ℃為PCR擴增程序的退火溫度。比較不同引物濃度的PCR擴增效果（圖2）發(fā)現(xiàn)，當引物終濃度低于0.7 μmol/L（泳道4）時，隨引物濃度的降低其擴增效果呈下降趨勢；引物終濃度為0.7～1.0 μmol/L（泳道1～4）時目的基因的擴增效率高且差異不明顯，因此確定0.8 μmol/L為最適引物濃度。優(yōu)化后的PCR反應體系50.0 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各2.0 μL，DNA模板5.0 μL，滅菌水補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

2. 2 PCR檢測方法的特異性

采用優(yōu)化后的PCR反應條件對副溶血性弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、霍亂弧菌和棲黑?；【?種弧菌屬細菌（共13株）及沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、致病性嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、肺炎克雷伯菌和無乳鏈球菌等9株非弧菌屬細菌進行PCR擴增檢測，結果（圖3）顯示，13株（泳道1～13）弧菌均可擴增出1130 bp的目的帶，而9株（泳道14～22）非弧菌屬菌株未擴增出任何條帶，表明建立的弧菌PCR檢測方法具有很強的特異性。

2. 3 PCR檢測方法的靈敏性

由圖4可看出，當菌懸液濃度≥102 CFU/mL（泳道1～7）時，PCR擴增電泳結果均可見預期的目的條帶；但菌懸液稀釋至10 CFU/mL時，經(jīng)PCR擴增后未出現(xiàn)任何條帶。說明該PCR檢測方法對弧菌的最低檢出限為102 CFU/mL。

2. 4 臨床應用效果

32份海水樣品均能分離獲得弧菌，共51株，提取各分離菌株的DNA進行dnaJ基因PCR檢測，結果顯示全部為陽性；陽性PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后進行BLAST同源比對分析，結果表明，從海水樣品中分離獲得的51株弧菌有5株為副溶血弧菌、16株為溶藻弧菌、12株為創(chuàng)傷弧菌、9株為河流弧菌、6株為哈氏弧菌、3株為棲黑海弧菌。36份對蝦樣品中有23份樣品分離出弧菌，共32株，提取各分離菌株的DNA進行dnaJ基因PCR檢測，結果顯示全部為陽性；陽性PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后進行BLAST同源比對分析，結果發(fā)現(xiàn)從對蝦分離獲得的32株弧菌有9株為副溶血弧菌、11株為溶藻弧菌、2株為創(chuàng)傷弧菌、3株為河流弧菌、7株為哈氏弧菌。對上述83株弧菌的dnaJ基因序列進行同源性比對分析并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果顯示，種間菌株的dnaJ基因序列相似度為79.5%～92.8%，種內(nèi)菌株間的dnaJ基因序列相似度為98.2%～99.9%；從基于dnaJ基因構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖5）也可看出，同種類的弧菌均聚為一個分支，種類區(qū)分清晰。

3 討論

弧菌是海水環(huán)境普遍存在的菌群之一，也是海水養(yǎng)殖中最常見的一種條件致病菌。海水養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大導致水產(chǎn)動物賴以生存的生態(tài)環(huán)境不斷惡化，細菌性疾病的發(fā)生和流行越來越嚴重，如近年來養(yǎng)殖凡納濱對蝦常暴發(fā)的急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）、早期死亡綜合征和紅體病等重大流行性疾病，且調(diào)查發(fā)現(xiàn)這些疾病與對蝦體內(nèi)常攜帶大量弧菌高度相關（陳健舜等，2012；文國樑，2015；徐含穎等，2015），說明弧菌已成為對蝦養(yǎng)殖過程中危害最嚴重的致病菌。鑒于弧菌的危害性，其檢測方法不斷更新發(fā)展，生理生化鑒定、PCR、環(huán)介導恒溫擴增（LAMP）、交叉引物恒溫擴增（CPA）、細菌多位點序列分型（MLST）及基因芯片等技術均被應用于弧菌的檢測與鑒定（秦瑞等，2016；殷紅秋等，2016；畢水蓮等，2017）；但這些鑒定方法均是針對特定的已知弧菌，對罕見或未知菌種難以鑒定，因此迫切需要一種能快速檢測并可鑒定種類的弧菌通用檢測方法。

dnaJ基因為弧菌屬細菌所共有，且在不同弧菌種內(nèi)高度保守，因此建立一種基于dnaJ基因的弧菌PCR檢測方法，并結合測序技術，即可實現(xiàn)對弧菌屬細菌的快速檢測及種類鑒定。本研究以dnaJ基因為靶基因，在其首尾的保守區(qū)域設計一對簡并引物，通過優(yōu)化退火溫度和引物濃度，成功建立了能擴增弧菌接近全長dnaJ基因的PCR檢測方法。該方法對弧菌屬細菌具有很強的特異性，其檢測靈敏度下限為102 CFU/mL。此外，本研究采用PCR快速擴增預混液，其快速的變性、退火及延伸速度可將PCR檢測時間縮短至1 h左右。應用該方法對51株分離自海水樣品的弧菌和32株分離自對蝦樣品的弧菌進行檢測，結果顯示全部為陽性；經(jīng)測序及同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，種間菌株的dnaJ基因序列相似度為79.5%～92.8%，種內(nèi)菌株間的dnaJ基因序列相似度為98.2%～99.9%，說明本研究建立的PCR檢測方法對海水環(huán)境、海水養(yǎng)殖水體及養(yǎng)殖動物體內(nèi)的弧菌檢測均具有良好適用性，同時可準確鑒定弧菌種類。

近幾年，以AHPND為首的對蝦病害肆虐各對蝦養(yǎng)殖區(qū)域，流行范圍遍及全國沿海所有對蝦主產(chǎn)區(qū)，已引起業(yè)界廣泛關注。已有研究表明，副溶血弧菌、哈維氏弧菌和坎貝氏弧菌等多種弧菌均可導致AHPND發(fā)生（劉志軒，2017）。本研究對36份對蝦樣品進行弧菌分離，結果從23份樣品中分離得到包括副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌在內(nèi)的5種弧菌共32株，說明廣西養(yǎng)殖對蝦體內(nèi)攜帶弧菌的現(xiàn)象非常普遍。正確診斷是有效防治疾病的前提，雖然弧菌的存在不一定會致病，但了解養(yǎng)殖水體及對蝦體內(nèi)弧菌的種類可為弧菌病的預警和防控提供參考。本研究基于dnaJ基因建立的弧菌PCR檢測方法能擴增出弧菌接近全長dnaJ基因，結合測序技術，可為弧菌快速篩查及種類鑒定提供更全面和更準確的技術手段。

4 結論

基于dnaJ基因建立的弧菌PCR檢測方法能擴增出弧菌接近全長dnaJ基因，具有快速便捷、靈敏準確、適應性好等優(yōu)點，結合測序技術，可為弧菌快速篩查及種類鑒定提供更全面和更準確的技術手段。

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（責任編輯 蘭宗寶）