董東曉 張東超 張文壯

摘要：文章綜述了新城疫病毒（NDV）的分子生物學(xué)特征、基因組結(jié)構(gòu)，同時(shí)，重點(diǎn)介紹病毒載體的研究進(jìn)展、反向遺傳學(xué)、新城疫病毒載體的應(yīng)用研究進(jìn)展等，為新城疫病毒載體的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：新城疫病毒；反向遺傳學(xué)；載體

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.00

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus， NDV）引起的一種禽類(lèi)的急性、高度接觸性、烈性傳染病[1]。不僅對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大損失，在世界范圍的危害也極大。弱毒苗和滅活苗雖然能有效控制該病，但它們都還存在一定的缺陷，新城疫基因工程苗相對(duì)優(yōu)越于傳統(tǒng)苗，所以，新城疫基因工程苗開(kāi)始引起重視。隨著反向遺傳學(xué)的建立[2]，新城疫病毒載體疫苗的研發(fā)逐漸活躍起來(lái)，為構(gòu)建新城疫和其他禽病的多聯(lián)苗奠定了基礎(chǔ)。

1 新城疫病毒分子的生物學(xué)特性

新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）為不分節(jié)段單股負(fù)鏈 RNA 病毒 （non segment negativesigle strain virus），本身不能作為 mRNA，不帶譯制病毒蛋白的信息，必須通過(guò)病毒自己的 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出一股互補(bǔ)鏈作為 mRNA。新城疫病毒的負(fù)鏈 RNA，一方面轉(zhuǎn)錄成 mRNA，合成相應(yīng)的病毒蛋白成分， 另一方面轉(zhuǎn)錄成其互補(bǔ)鏈 ，再合成病毒 RNA 鏈，參與病毒包裝。新城疫病毒粒子中心是一個(gè)與蛋白質(zhì)相連接的單股負(fù)鏈 RNA所形成的螺旋形核衣殼，外包一雙層脂質(zhì)囊膜，內(nèi)襯有一層特殊的 M蛋白，囊膜外有大小2種糖蛋白纖突，前者具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性的 HN 蛋白組成，后者具有融合功能的 F蛋白組成。

1.1 新城疫病毒的形態(tài)特征

新城疫病毒又稱亞洲雞瘟病毒、偽雞瘟病毒或禽腦肺炎病毒，屬于副粘病毒科、副黏病毒亞科、腮腺病毒屬、禽副粘病毒I型（APMV-I）。成熟的新城疫病毒粒子的直徑為100～250 nm，由囊膜和核衣殼兩部分構(gòu)成，囊膜是宿主細(xì)胞外膜脂類(lèi)與病毒糖蛋白結(jié)合而形成的，表面有刺突，刺突長(zhǎng)為8～12 nm，核衣殼是由病毒核酸和蛋白質(zhì)衣殼粒結(jié)合后，對(duì)稱螺旋纏繞而成，直徑約為18 nm。新城疫病毒的核酸為單鏈負(fù)股、不分節(jié)RNA[3]（non segment negative single-stranded RNA，ssRNA）。

1.2 新城疫病毒的基因組結(jié)構(gòu)

如圖1所示，新城疫病毒的基因結(jié)構(gòu)包括NP、P、M、F、HN和L6個(gè)基因，基因組全長(zhǎng)約為15kb；在基因組開(kāi)放閱讀框（ORF）外側(cè)的3端有長(zhǎng)為55nt的引導(dǎo)序列，5端有長(zhǎng)為114nt或56nt的尾隨序列。6個(gè)基因分別編碼核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN）和大蛋白（L），leader序列和trailer序列在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起到對(duì)基因組的調(diào)控作用。基因組所編碼的蛋白中HN、F、M蛋白為外部蛋白，F(xiàn)和HN蛋白位于囊膜的表面，M蛋白即與外膜蛋白相連，又與核衣殼相接。F蛋白在蛋白酶的作用下由前體F0裂解成F1和F2[4]，才能激發(fā)病毒的囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，使病毒具有感染力；HN纖突蛋白中HA（血凝素）可識(shí)別唾液酸受體并與之結(jié)合，NA（神經(jīng)氨酸酶）具有切除病毒表面的唾液酸將組裝好的病毒粒子與宿主分離的功能；蛋白對(duì)病毒囊膜的形成有重要作用，其功能在于參與病毒的組裝和調(diào)節(jié)病毒RNA的合成，使病毒具有感染性。NP蛋白、P蛋白、L蛋白為內(nèi)部蛋白，與病毒RNA復(fù)合形成病毒的核衣殼；沒(méi)有內(nèi)部蛋白參與，RNA不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制；病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制需要內(nèi)部蛋白的共同參與，形成具有活性的mRNA。

2 病毒載體的研究進(jìn)展

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，活載體疫苗已被廣泛研究和應(yīng)用，它不僅克服了滅活苗的免疫性差和弱毒苗的毒力返強(qiáng)，而且具備了滅活苗安全性好和弱毒苗可產(chǎn)生局部免疫的優(yōu)點(diǎn)，與此同時(shí)，活載體疫苗還具有構(gòu)建多價(jià)苗和多聯(lián)苗的優(yōu)點(diǎn)。在生物界中，病毒是最為簡(jiǎn)單的微生物，因此，病毒載體為載體疫苗的研究和應(yīng)用拓展了新思路。病毒分子生物學(xué)的研究逐漸成為熱門(mén)，尤其基因重組等技術(shù)的建立使各種病毒作載體成為可能，研究已發(fā)現(xiàn)有多種病毒可作為安全可靠的載體，如痘病毒載體、腺病毒載體、皰疹病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體及副粘病毒載體等。

2.1 痘病毒載體

痘病毒為最大的DNA病毒，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有核心、側(cè)體和包膜，呈磚形或橢圓形。痘病毒核酸為單線雙鏈DNA，基因組長(zhǎng)130～300kb[5]。

痘病毒為載體在畜禽疫苗上研發(fā)和應(yīng)用極其廣泛，從牛痘病毒可以預(yù)防人類(lèi)天花，到痘疫苗代替牛痘病毒，再后來(lái)通過(guò)基因工程對(duì)豆苗病毒進(jìn)行致弱，為痘病毒載體的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。將牛瘟病毒基因組上的H基因重組到痘苗病毒基因組上進(jìn)行表達(dá)，以及禽痘病毒基因組上重組新城疫、馬立克等病毒的基因片段表達(dá)。另外，修飾豆苗病毒安卡拉、豆苗病毒稿件痘苗、金絲雀痘病毒、粘液瘤病毒、豬痘病毒、山羊逗病毒等作載體也有相當(dāng)多的研究。

2.2 腺病毒載體

腺病毒屬于腺病毒科，包括禽病毒屬和哺乳動(dòng)物腺病毒屬。腺病毒核酸是由線狀雙股DNA組成，外無(wú)囊膜，而是20面體的蛋白衣殼；衣殼由240個(gè)六鄰粒和12個(gè)五鄰粒組成，六鄰粒構(gòu)成20面體的20個(gè)面及棱，五鄰粒分別位于20面體的12個(gè)頂點(diǎn)。腺病毒的基因組長(zhǎng)為36kb。

腺病毒腺病毒的基因組較大，具有能容納相當(dāng)大片段的外源基因的潛力；而且對(duì)插入的外源基因高效表達(dá)的突出優(yōu)點(diǎn)。目前對(duì)豬、綿羊、牛、犬、禽等腺病毒作載體研究相對(duì)成熟，也已取得很大的成果，如豬腺病毒為載體重組豬瘟病毒表達(dá)gp55蛋白等；禽腺病毒為載體分別重組雞傳染性法氏囊病毒表達(dá)VP2蛋白、雞傳染性支氣管炎病毒表達(dá)纖突蛋白，等等。

2.3 皰疹病毒載體

皰疹病毒科有4個(gè)亞科：甲、乙、丙及未定名亞科。皰疹病毒是中小型雙股DNA病毒，皰疹病毒的基因組約為150kb。

皰疹病毒一般經(jīng)黏膜途徑感染宿主，因此，皰疹病毒載體疫苗的可通過(guò)黏膜接種免疫。目前皰疹病毒或載體主要有牛皰疹病毒I型和Ⅳ型、犬皰疹病毒、火雞皰疹病毒、馬立克病病毒、傳染性喉氣管炎病毒、偽狂犬病病毒等。偽狂犬病毒載體疫苗應(yīng)用相對(duì)比較成熟的載體，如將經(jīng)典豬瘟病毒、口蹄疫病毒、傳染性胃腸炎病毒、圓環(huán)病毒-2、豬流感病毒、寄生蟲(chóng)等基因片段重組到偽狂犬病毒基因組表達(dá)相應(yīng)的抗原。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒的一種，核心呈對(duì)稱的20面體，核心有核糖蛋白，外有囊膜包裹。核酸由雙股正鏈RNA構(gòu)成。

一般逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包膜蛋白以及包裝細(xì)胞系共同組成反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)，具有對(duì)重組基因高效表達(dá)的能力。逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體可以感染各種細(xì)胞，而且感染率比較高，可達(dá)100%；而且轉(zhuǎn)入的外源基因可以完全整合。哺乳動(dòng)物及鳥(niǎo)類(lèi)中存在許多逆轉(zhuǎn)錄病毒，如鼠類(lèi)的乳腺腫瘤病毒，莫洛氏小鼠白血病病毒，鳥(niǎo)類(lèi)脾壞死病毒等，目前，對(duì)勞斯肉瘤病毒研究最為清晰。

2.5 副粘病毒載體

副粘病毒形狀多樣，直徑100 nm以上，病毒由囊膜和核衣殼構(gòu)成，核衣殼由一條連續(xù)的負(fù)股RNA單鏈及蛋白結(jié)合，呈螺旋對(duì)稱。

隨著反向遺傳學(xué)的建立，反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的RNA病毒載體成為可能，尤其是副粘病毒載體的研究比較活躍。目前副粘病毒科中新城疫病毒載體的研究已比較成熟，如以新城疫病毒為載體插入氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因、綠色熒光蛋白（GFP）基因、禽流感病毒HA基因、傳染性法氏囊病毒VP2基因等，都能將外源基因高水平的表達(dá)。

3 新城疫病毒為載體的研究進(jìn)展

3.1 反向遺傳操作技術(shù)

反向遺傳學(xué)（reverse genetics）是相對(duì)于經(jīng)典的遺傳學(xué)而言的。反向遺傳操作技術(shù)也叫感染性cDNA克隆技術(shù)，是將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在病毒的cDNA水平上進(jìn)行體外基因改造（如基因位點(diǎn)的突變、插入、缺失、轉(zhuǎn)換等），再將包裝好的病毒基因或直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞或易感宿主中，拯救出具有感染性RNA活的病毒或類(lèi)似病毒的物質(zhì)，根據(jù)拯救出的新病毒的表現(xiàn)特性研究RNA病毒基因組的結(jié)構(gòu)、功能及研究應(yīng)用等，通常又被稱為“病毒拯救（the rescue of virus）”，主要包括RNA干擾技術(shù)、基因沉默技術(shù)、基因體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)等。反向遺傳學(xué)技術(shù)在新城病毒載體上的應(yīng)用已相對(duì)成熟。

3.2 新城疫病毒作載體的優(yōu)點(diǎn)

重組新城疫病毒作為活病毒載體的優(yōu)點(diǎn)極多。新城疫病毒為負(fù)鏈RNA病毒，不能通過(guò)DNA復(fù)制，從RNA到RNA，并且整個(gè)復(fù)制過(guò)程在細(xì)胞漿中進(jìn)行，病毒基因組將不會(huì)整合到宿主基因組中，所以，新城病毒作載體的安全性要高于DNA病毒作載體。NDV病毒作載體能很好的刺激病毒宿主產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫以及局部黏膜免疫，對(duì)機(jī)體有較強(qiáng)的免疫保護(hù)；并可以長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)抗原基因，維持產(chǎn)生的高抗體滴度。由于新城疫存在普遍性，新城疫已為家禽防疫的重點(diǎn)病之一[6]，所以，重組新城疫病毒做活病毒載體有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。新城疫弱毒苗生產(chǎn)成本低廉，而且新城疫疫苗的接種方式很多（滴鼻、點(diǎn)眼、噴霧、飲水、注射等），使用很方便。新城疫的遺傳特性相對(duì)穩(wěn)定，只有一個(gè)血清型，毒株間的重組及毒力返強(qiáng)的可能性較小。NDV病毒對(duì)人沒(méi)有感染性，野生型新城疫病毒也僅會(huì)引起有輕微的病癥，因此，弱毒新城疫對(duì)人是安全的。由于新城疫病毒在的優(yōu)點(diǎn)諸多，而且反向遺傳系統(tǒng)的建立，新城疫病毒作載體的研究越來(lái)受重視。

3.3 新城疫病毒為載體的應(yīng)用研究進(jìn)展

2000年，Krishnamurthy和Huang[7]等將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因插入由中等毒力菌株Beaudette C重組的rNDV/BC基因組HN和L之間而獲得重組新城疫病毒rNDV/BC/CAT，并發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)新城疫病毒cDNA的改變會(huì)影響rNDV的復(fù)制，但外源基因的插入使Beaudette C的毒力減弱[13]。后來(lái)，又以新城疫弱毒Lasota株為載體，在其基因組3端緊靠NP基因插入CAT基因，獲得重組新城疫病毒rLasota/CAT，并證明在新城疫病毒基因組的3端插入外源基因不影響其親本毒力。一系列的研究表明新城疫病毒可以作為一種新的活疫苗載體。

2003年，Engel-Herber[8]等以NDVClone-30株為載體，將綠色熒光蛋白（GFP）基因插入到載體基因組F基因和NH基因之間，重組獲得新城疫病毒rNDV/GFP1，并發(fā)現(xiàn)獲得的rNDV/GFP1和親本病毒株在雞胚中的復(fù)制能力及致病性基本一致，而且新的重組病毒能在雞胚中穩(wěn)定的表達(dá)GFP。另外，在新城疫病毒感染細(xì)胞試驗(yàn)中，感染病毒rNDV/GFP1株的細(xì)胞能檢測(cè)到GFP，而感染病毒Clone-30株的細(xì)胞不能表達(dá)GFP[14]。這對(duì)研究新城疫病毒病毒跟蹤奠定基礎(chǔ)，可以根據(jù)GPF的特性對(duì)病毒侵襲宿主的組織器官以及嚴(yán)重程度確定，同時(shí)，再次證明新城疫病毒是一種非常有前景的活疫苗載體。

2003年，Zhao[9]等將人的分泌型堿性磷酸酶（SEAP）基因分別插入到新城疫病毒基因組的NP與P基因之間、M與F基因之間、HN與L基因之間以及L基因之后，獲得4株重組新城疫病毒株（rNDV/SEAP/NP-P、rNDV/SEAP/M-F、rNDV/SEAP/HN-L、rNDV/SEAP/L），以無(wú)毒株NDFL為親本對(duì)照進(jìn)行研究試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重組新城疫病毒株產(chǎn)生的病毒滴度要低于親本毒株的抗體滴度，而且前，3株毒株對(duì)SEAP的表達(dá)量高于第4株重組新城疫毒株對(duì)SEAP的表達(dá)量[15]。感染雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）產(chǎn)生的蝕斑結(jié)果也相似，另外，重組新城疫病毒的復(fù)制的起始時(shí)間相對(duì)親本毒株有所延遲，尤其是rNDV/SEAP/NP-P毒株。研究中的外源基因插入不同的位點(diǎn)，外源基因的表達(dá)量不同，而且對(duì)新城疫病毒產(chǎn)生的抗體滴度的影響也不同。因此，這對(duì)研究以新城疫病毒為載體，插入外源基因的合適位點(diǎn)有一定的指導(dǎo)意義；另外，也對(duì)新城疫病毒為載體插入多個(gè)外源基因構(gòu)建多聯(lián)苗奠定基礎(chǔ)。

2004年，Huang等以新城疫病毒弱毒Lasota株為骨架，將雞傳染性法氏囊病毒變異株IBDV/GLS-5的VP2基因插入到Lasota基因組的3端，獲得重組新城疫病毒rLasota/VP2。該毒株對(duì)2日齡SPF雛雞免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示：rLasota/VP2可以對(duì)IBDV/GLS-5株和強(qiáng)度NDV/Texas株產(chǎn)生90%以上的保護(hù)力；若加強(qiáng)免疫，保護(hù)力可達(dá)到100%。試驗(yàn)首次展示了構(gòu)建新城疫病毒作其他病毒的疫苗的載體實(shí)例，證明了新城疫病毒作載體疫苗的可行性。

2006年，葛金英等將野生突變型H5亞型高致病性禽流感的HA基因插入到新城疫病毒Lasota株的P和M基因之間，獲得重組病毒rLasota-HAmut。另外，通過(guò)免疫學(xué)試驗(yàn)證明，rLasota-HAmut作為載體疫苗具有良好的免疫原性及安全性[16]。Veits等將H5亞型的HA基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）插入到NDV Clone-30基因組的F和HN基因之間，再通過(guò)對(duì)ORF進(jìn)行基因改造，獲得重組毒株NDVH5m。并通過(guò)試驗(yàn)證明，NDVH5m可作為較為合適的載體疫苗選擇株。

2008年，葛金英等以NDV Lasota弱毒株為載體，將超強(qiáng)傳染性法氏囊（vvIBDV）的VP2基因插入到Lasota株基因組P基因和M基因之間，拯救出病毒rLasota-VP2株。通過(guò)重組病毒雞胚生長(zhǎng)特性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該毒株具有和親本Lasota毒株在雞胚中重高滴度和低致病力的特性；致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組病毒有極高的穩(wěn)定性；對(duì)7日齡雛雞免疫試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組rLasota-VP2對(duì)新城疫強(qiáng)度F48E9株有100%的免疫保護(hù)力，對(duì)vvIBDV Gx株的保護(hù)力力在90%以上[17]。試驗(yàn)為研制新城疫和傳染性法氏囊病二聯(lián)苗奠定基礎(chǔ)，此研究再次強(qiáng)有力的說(shuō)明了新城疫病毒載體的可行性。

2009年，Nayak B等以NDV Lasota為載體，重組高致病性禽流感的HA基因，獲得rNDV-HA，并證明該重組株對(duì)H5N1亞型禽流感及強(qiáng)毒新城疫有較強(qiáng)的保護(hù)力。同年，胡順林等和陳化蘭等也做了類(lèi)似的試驗(yàn)，并獲得理想的結(jié)果[18]。

2010年，天津農(nóng)學(xué)院焦利紅[12]以NDV弱毒苗rLasota和突變修飾的變異株rLasota-FmF為載體，將IBV Masasachusetts41株的S基因分別插入到rLasota的P和M基因之間，將S1基因分別插入到rLasota和rLasota-FmF的P和M基因之間，分別拯救出重組新城疫病毒rL-IBVS、rL-IBVS1和rL-FmF，這將為構(gòu)建NDV載體的ND和IB二聯(lián)苗奠定基礎(chǔ)。

4 展望

近年來(lái)，新城疫病毒的生物學(xué)特性及基因結(jié)構(gòu)等研究已較為清晰。伴隨反向遺傳學(xué)技術(shù)的更新，新城疫病毒作為載體研究已取得較為顯著地成就，為預(yù)防新城疫的同時(shí)預(yù)防其他禽病開(kāi)辟了新思路。另外，新城疫病毒載體的研究相對(duì)其他RNA病毒載體的研究較為成熟，且新城疫病毒載體的安全性有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，由此可見(jiàn)，新城疫病毒載體的前景會(huì)越來(lái)越廣闊。

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