肖小芹 湯婉婷 成紹武 鄧桂明

〔摘要〕 目的 比較研究棉簽法、生理鹽水沖洗法進行陰道涂片，HE染色法、瑞氏染色法、巴氏染色法染色對C57BL/6小鼠陰道涂片細胞組織染色的效果，為小鼠動情周期的確定尋找便捷、有效的檢驗方法。方法 對10只C57BL/6雌性小鼠分兩籠飼養(yǎng)，每日10∶00用棉簽法、生理鹽水法進行陰道涂片，連續(xù)15 d，并使用HE染色法、瑞氏染色法、巴氏染色法，觀察記錄。結(jié)果 連續(xù)實驗生理鹽水法優(yōu)于棉簽法，HE染色染料易于獲得；瑞氏染色分型清楚，染色佳；巴氏染色形態(tài)清晰，分色明顯，透明度好。結(jié)論 大樣本量旨在判斷動情周期的發(fā)生與改變實驗應(yīng)采用瑞氏染色法，可輔以巴氏染色以增強實驗動物數(shù)據(jù)資料的可靠性。

〔關(guān)鍵詞〕 C57BL/6；動情周期；陰道涂片；HE染色；瑞氏染色；巴氏染色

〔中圖分類號〕R34 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.003

〔Abstract〕 Objective To compare the staining effect of HE staining， Wright staining and Pap staining on the cell smear of C57BL/6 mice， and to find a relatively simple and effective staining method for identification of estrous cycle. Methods The 10 female C57BL/6 mice were taken vaginal smear at 10：00 every morning， with the course of 15 days. The results were analyzed by HE staining， Wright staining and Papanicolaou stainining methods. Results The normal saline method was better than swab method. HE staining method was simple and easy. Wright staining method was clear with obvious color separation. Papanicolaou stainining was with good diaphaneity. Conclusion The Wright staining method is firstly selected in large sample examination of mice vaginal smear for estimating the development of estrous cycle. The reliability of experimental information can be supplemented by Papanicolaou stainining method.

〔Keywords〕 C57BL/6； estrous cycle； vaginal smear； HE staining； Wright staining； Papanicolaou stainining

小鼠作為常用的實驗動物之一，雌性小鼠廣泛應(yīng)用于生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病研究[1]。小鼠動情周期的變化是評價生殖系統(tǒng)功能的一項重要指標，其性周期一般為4～6 d，可依據(jù)動物的性表現(xiàn)及生殖器官變化將動情周期分為動情前期、動情期、動情后期及動情間期[2]。小鼠生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)隨性周期發(fā)生一系列組織、生理學變化，進而體現(xiàn)在陰道細胞形態(tài)及比重的改變，因而，陰道涂片可簡便快捷的體現(xiàn)動情周期而成為目前常用的判定小鼠性周期的方法之一[3]。但C57BL/6成年雌鼠體質(zhì)量較小，性情較為暴躁，現(xiàn)有文獻所述陰道涂片技術(shù)實際操作中存在一定問題，文獻記載染色方法缺乏直觀對比，本試驗對C57BL/6小鼠陰道涂片方法進行優(yōu)化，并對常用的三種染色方法進行比較研究，旨在建立快速、簡單、可靠的陰道涂片方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取54～58日齡，體質(zhì)量18～20 g，性成熟的C57BL/6雌鼠10只，SPF級，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供（實驗單位使用許可證編號：SYXK（湘）2013-0005；許可證號：SCXK（湘）2016-0002）。

1.1.2 飼養(yǎng)條件 室內(nèi)溫度為23～27 ℃，相對濕度為45%～55%，明暗周期為12/12 h，分兩籠飼養(yǎng)，試驗期間自由飲用滅菌純化水（滅菌方法：經(jīng)121 ℃滅菌30 min，有效期14 d），食用標準普通維持飼料。

1.1.3 器材與試劑 OLYMPUS CH30型光學顯微鏡（北京城夕科技有限公司）。滅菌牙簽，無菌脫脂棉球，10 μL移液槍、10 μL Tip頭、玻片（載玻片、蓋玻片）、醫(yī)用生理鹽水。Ehrilich蘇木素液[4]（將蘇木素2 g溶于100 mL純乙醇，再將15 g鉀明礬溶于100 mL蒸餾水中，溶解后將甘油傾入混合，然后加入蘇木素乙醇混合液，最后加入10 mL冰醋酸，充分混勻后暴露在日光下自然成熟3個月），伊紅染液[伊紅Y（水溶）0.5～1 g，蒸餾水99 mL混勻]，瑞氏（Wright）染液[5]（瑞氏染料粉1 g放入研缽內(nèi)，加中性甘油10 mL，研磨至細糊狀時，慢慢加入600 mL甲醇，充分溶解，移至棕色瓶內(nèi)1周后即可使用），磷酸鹽緩沖液（10 g/L磷酸二氫鉀30 mL，10 g/L磷酸氫二鈉20 mL，蒸餾水加至1 000 mL），巴氏染色液Papanicolaou EA36（品牌：Solarbio，貨號：G1612）。

1.2 方法

每日10：00對兩籠小鼠分別使用自制棉簽法及生理鹽水沖洗法進行陰道涂片，并進行HE染色、瑞氏染色及巴氏染色。

1.2.1 陰道涂片 自制棉簽法[1]：將牙簽頂端尖銳處剪去，從脫脂棉球上撕取2 cm×2 cm大小棉絮，折疊纏繞于牙簽頂端。將自制棉簽于生理鹽水中浸濕，插入小鼠陰道約5 mm，順牙簽纏繞方向旋轉(zhuǎn)1周后取出，順牙簽纏繞方向于清潔載玻片上滾動1周。自然干燥玻片。

生理鹽水沖洗法[6]：取10 μL移液槍，裝10 μL Tip頭后，吸取10 μL生理鹽水，將槍頭插入小鼠陰道約5 mm，吹打2～3次后吸出10微升，滴至載玻片，均勻鋪開至1.5 cm×2 cm左右，自然干燥玻片。

1.2.2 HE染色 陰道涂片自然干燥后浸潤蘇木素染液染色5～10 min；流水沖洗；鹽酸乙醇分色數(shù)秒（根據(jù)涂片染藍色的深淺確定時間）；自來水浸泡返藍5 min；伊紅染液染色3 min；流水沖洗；干燥，封片，鏡檢[4]。

1.2.3 瑞氏染色 陰道涂片自然干燥后滴加瑞氏染劑數(shù)滴（按涂片面積大小而定），靜置1 min（如天氣炎熱，時間應(yīng)縮短，以防止染液干涸。若染液揮發(fā)，表面趨于干燥，應(yīng)即增添染液）；加相當于染液1.5倍的磷酸鹽緩沖液，與染液混勻，保持約10 min；流水沖洗（沖洗時應(yīng)將玻片平放，緩緩加水，切勿先傾去染料，否則涂片易殘留染料沉淀物）；干燥，封片，鏡檢[7]。

1.2.4 巴氏染色 陰道涂片自然干燥后放入95%乙醇固定3～5 min；85%乙醇2 min；80%乙醇2 min；70%乙醇2 min；流水沖洗；放入染色試劑盒內(nèi)A：蘇木素染色5 min；流水沖洗；B：藍化液藍化5 min；C：G6染液染色5 min；入95%乙醇分色數(shù)秒；D：EA36染液染色5 min；兩次95%乙醇分色各數(shù)秒；干燥，封片，鏡檢。（此方法在染色試劑盒附說明書基礎(chǔ)上根據(jù)試驗情況進行了優(yōu)化）。

2 結(jié)果

2.1 陰道涂片方法的選擇

連續(xù)多日采集陰道涂片后，棉簽組小鼠陰道口明顯紅腫，且操作速度相對較慢。移液槍組小鼠陰道口未見紅腫，操作過程中未見陰道出血，且操作速度較快。

2.2 HE染色

細胞核被蘇木素染成藍紫色，角化細胞、細胞漿、嗜伊紅顆粒等被伊紅Y染成不同程度的粉紅色，白細胞分葉核較明顯。如圖1。

2.3 瑞氏染色

細胞核被蘇木素染成深藍紫色，角化細胞、細胞漿等被染成不同程度的淺藍紫色，白細胞分葉核較明顯。如圖2。

2.4 巴氏染色

細胞核被染成深藍色，完全角化細胞胞漿染成橘黃色，不完全角化細胞被染成不同程度的粉紅色，中間層、基底層表皮細胞被染成青色、藍色，白細胞被染成藍色且分葉核明顯，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰。如圖3。

3 討論

通過取材、染色、鏡檢分析，就陰道涂片方法而言，移液槍生理鹽水沖洗法簡便、高效，涂片污染少，新手易于操作。就陰道涂片染色方法而言，HE染色法技術(shù)成熟，染料易于獲得，鏡下動情間期易于辨別，但對角化細胞及中間層細胞區(qū)別較弱，取材部位過深易誤判為動情前期或后期；瑞氏染色法步驟簡略，操作便捷，省量節(jié)能，鏡下動情期、動情間期明顯，動情前期雜質(zhì)易染色，故易于判斷，但對鱗狀上皮細胞角化程度區(qū)別度較小，取材部位對動情周期判斷影響較小。巴氏染色對不同的細胞及不同分化程度的角化細胞染成不同顏色，分色明顯，透明度好，便于鑒別、區(qū)分動情分期，且可排除取材過深的影響，實驗結(jié)果準確，但操作較前復(fù)雜，成本較高。

綜上，長時間連續(xù)涂片應(yīng)采用生理鹽水沖洗法進行陰道涂片取材。實驗樣本量大，旨在判斷動情周期的發(fā)生與改變可應(yīng)用瑞氏染色法；實驗樣本量小，旨在明確動情各期改變，或?qū)﹃幍烂撀浼毎螒B(tài)、比率進行研究時應(yīng)采用巴氏染色法。臨時染色、準確度要求較低時可采用HE染色法，但需注意采用棉簽法，且取材不宜過深，防止細胞混雜。

參考文獻：

[1] 秦 川，魏 泓.實驗動物學[J].北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：164.

[2] 覃海章，肖勝軍，華英杰，等.不同方法確定動情周期及動情期生殖器官結(jié)構(gòu)[J].安徽醫(yī)科大學學報，2017，52（11）：1650-1653.

[3] 宋孟秋，馬永生，曹玉鳳，等.小鼠發(fā)情周期中黃體大小及細胞的數(shù)量變化規(guī)律[J].動物醫(yī)學進展，2015，36（11）：31-35.

[4] 高登慧，龔 寧，裴占陽，等.動物組織胚胎學實驗指導(dǎo)[M].貴陽：貴州大學出版社，2014：60-65.

[5] 臧貴勇，張祥令，楊燕平.快速Wright液與改進的Wright液染色比較分析[J].重慶醫(yī)學，2017，46（5）：676-677.

[6] 荊寶琴.成年SD大鼠不同陰道涂片方法探索[A].中國毒理學會第七次全國毒理學大會暨第八屆湖北科技論壇論文集[C].中國毒理學會、湖北省科學技術(shù)學會，2015：1.

[7] JOHN D BANCROFT， MARILYN GAMBLE.組織學技術(shù)Theory and Practice of Histological Techniques：英文[M].北京：北京大學醫(yī)學出版社，2008：105-108.