李果果　陳香玲　秦榮耀　劉要鑫　趙小龍　孫寧靜　歐智濤　唐志鵬　張廣珍

摘要：【目的】分析大果沙糖橘的遺傳特性和引種栽培表現(xiàn)，為豐富廣西沙糖橘種類提供參考依據(jù)。【方法】利用倍性分析和AFLP分子標記對引種的大果沙糖橘進行遺傳鑒定，并觀測其生長發(fā)育特性和物候期，分析果實的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀?！窘Y果】倍性鑒定結果表明，大果沙糖橘的倍性與沙糖橘均為二倍體；AFLP分子標記分析結果表明，大果沙糖橘的遺傳物質(zhì)有別于沙糖橘、廣蜜橘、南豐蜜橘、桂青橘1號、青皮橘和春甜橘，具有遺傳特異性，是一種新的柑橘種質(zhì)材料。經(jīng)2005～2016年栽培觀測，大果沙糖橘植株長勢旺盛，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)；平均單果重69.0 g，果實平均縱徑40.7 mm，平均橫徑53.4 mm，果實扁圓形，平均果皮厚2.5 mm，可食率74.4%；平均可溶性固形物含量13.0%，可滴定酸含量0.28%，維生素C（Vc）含量33.2 mg/100 gFW；果皮橙黃至橙紅色，油胞凸出，果面稍粗糙，少核，在廣西崇左市成熟期為12月?！窘Y論】大果沙糖橘是具有遺傳特異性的新型柑橘種質(zhì)資源，產(chǎn)量較高，穩(wěn)產(chǎn)性好，品質(zhì)較佳，適應性強，適合在廣西沙糖橘產(chǎn)區(qū)推廣種植。

關鍵詞： 大果沙糖橘；遺傳鑒定；引種；栽培表現(xiàn)

中圖分類號： S666 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）06-1171-06

Abstract：【Objective】The genetic character and planting performance of the Citrus cultivar Daguo shatangju was ana-lyzed to provide references in order to enrich the variety of Guangxi Shatangju. 【Method】Ploidy analysis and AFLP molecular marker were used to determine the genetics of Daguo shatangju. The botanical characteristics，phenology，yield and fruit character were observed and analyzed. 【Result】The ploidy analysis result showed that Daguo shatangju was diploid，the same as Shatangju. The AFLP molecular marker showed that the genetic material of Daguo shatangju was different from Shatangju， Guangmiju， Nanfengmiju， Guiqingju No.1， Qingpiju and Chuntianju. It was a new Citrus gerplasm resource. Through observation during 2005-2016，it was found that the growth vigor of Daguo shatangju was flourishing. The yield was high and stable. The average fruit mass was 69.0 g. The fruit was oblate with average longitudinal diameter 40.7 mm and average transverse diameter 53.4 mm. The average pericarp thickness was 2.5 mm，edible rate 74.4%，the average total soluble solids content 13.0%，the acid content 0.28 g and vitamin C（Vc） content 33.2 mg/100 gFW. The fruit peel was orange or salmon. The oil cell was little rough and obvious. It was a few-seed cultivar，mature in December in Chongzuo， Guangxi. 【Conclusion】Daguo shatangju is a new Citrus gerplasm resource with genetic specificity，which can be grown extendedly throughout Guangxi Shatangju planting areas due to its high yield，stability， good quality and strong adaptability.

Key words： Daguo shatangju； genetic identification； introduction； cultivation performance

0 引言

【研究意義】沙糖橘原產(chǎn)廣東省四會市，廣西于1994年引種，迄今已成為廣西柑橘主要栽培品種之一。據(jù)不完全統(tǒng)計，截至2014年廣西沙糖橘栽培面積約6. 67萬ha，產(chǎn)量約100萬t（區(qū)善漢等，2014；張錦松等，2015），但存在品種單一、果實偏小等問題，未能滿足市場需求。廣西大學和廣西農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所于2011年在廣西崇左市柑橘園實地調(diào)查時發(fā)現(xiàn)大果型沙糖橘品系，此后經(jīng)過多年觀察和分析，大果型沙糖橘在葉片、枝條和果實大小等方面與沙糖橘存在明顯差異，具有品種特異性，是沙糖橘大果型新品系，被命名為大果沙糖橘，2015年通過廣西壯族自治區(qū)農(nóng)作物品種審定委員會審定（編號2015001號），但對其遺傳特性鑒定的研究未見報道。果樹遺傳鑒定方法主要有流式細胞術、RAPD、SSR、AFLP、MSAP和基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的標記，其中AFLP作為重復性和穩(wěn)定性較好的分子標記技術，能提供較多的信息量，在柑橘變異材料的鑒定中應用較廣泛（張敏和鄧秀新，2006）。流式細胞術是一種較快速鑒定果樹倍性的方法，操作簡單，已普遍應用于果樹遺傳鑒定（謝宗周等，2010；傅翠娜等，2014）。因此，利用流式細胞術和AFLP分子標記鑒定大果沙糖橘的遺傳特性，分析其引種栽培表現(xiàn)，對豐富廣西沙糖橘種類具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】20世紀80年代，華南農(nóng)業(yè)大學的陳大成以十月橘（二倍體）嫁接苗為試材，通過秋水仙素誘變處理獲得四倍體十月橘，果實單果重72.8 g，果形指數(shù)0.75（甘廉生和唐小浪，2013），是目前唯一報道的大果型沙糖橘品系。采用流式細胞儀對植物材料的DNA倍性進行分析，結果準確度高，且DNA含量可在分布圖上直觀體現(xiàn)（張俊娥等，2003）。謝宗周等（2010）利用流式細胞儀檢測確定桂橙1號為二倍體。AFLP技術是迄今最有效的分子標記方法，操作方便快速，只需極少量DNA材料即可檢測整個基因組的遺傳變異，已廣泛應用于果樹遺傳多樣性研究和品系鑒定，如王平等（2012）應用AFLP技術對16個輻射誘變和芽變的柑橘品系及其親本進行遺傳差異分析，發(fā)現(xiàn)16個變異材料的遺傳基礎均發(fā)生了不同程度變異；肖遠輝等（2012）從64對引物中篩選出12對AFLP引物組合，能將12份柚類材料區(qū)分開，從而證實早熟沙田柚和桂柚1號是不同于沙田柚的變異新種質(zhì)，可直接作為品種資源加以利用?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對大果沙糖橘遺傳鑒定、生長發(fā)育特性和引種栽培表現(xiàn)的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】對廣西崇左市引進的大果沙糖橘進行遺傳鑒定，觀測其生長發(fā)育特性、物候期和果實性狀等栽培表現(xiàn)，為大果沙糖橘在廣西的推廣種植提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗地概況

試驗于2011年12月～2016年12月在崇左市江洲區(qū)左江華僑農(nóng)場區(qū)扶分場進行。崇左市地處北回歸線以南，屬亞熱帶濕潤季風區(qū)，年日照時數(shù)1600 h，年均氣溫20.8～22.4 ℃，年無霜期340 d，年降水量1200 mm以上，光照充足，雨熱同季（覃妙齡等，2013）。土壤質(zhì)地為酸性土壤，pH 5.1，有機質(zhì)含量24.3 g/kg，全氮含量0.133%，水解氮含量93.0 mg/kg，速效鉀含量130.0 mg/kg，有效磷含量33.6 mg/kg。

1. 2 試驗材料

試驗樹于2005年從廣東省英德市英德農(nóng)場引進種植，砧木為枳殼，株行距2.0 m×3.5 m（按1425株/ha種植）。于2011年開始對7年生樹進行倍性分析、利用AFLP分子標記進行遺傳多樣性鑒定及其觀測引種表現(xiàn)。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 倍性分析 參照張俊娥等（2003）的方法，采用PA-I流式細胞儀（德國Partec公司）對試驗樹進行倍性檢測，以二倍體早花檸檬的葉片為對照。具體檢測方法：選取約0.5 cm2幼嫩葉片于塑料皿中，加入400.0 μL HR-A核裂解液，用刀片切碎葉片后放置30 s，以20.0～50.0 μL微孔濾膜將樣品過濾到小試管中，加入1.6 mL HR-B DAPI染色液染色30～60 s，然后上樣品檢測。采用PA-I流式細胞儀測定樣品中單個細胞核的DNA總量，DNA含量的分布曲線由儀器自動生成（謝宗周等，2010）。

1. 3. 2 AFLP分子標記鑒定 參考肖遠輝等（2012）的方法，稍加改良，采用AFLP分子標記對試驗樹、沙糖橘、廣蜜橘、南豐蜜橘、桂青橘1號、青皮橘和春甜橘進行DNA提取、限制性酶切及連接反應、預擴增和選擇性擴增比較，以確定試驗樹的遺傳特異性。

1. 3. 3 栽培表現(xiàn)觀測 2011～2016年期間對大果沙糖橘進行生長發(fā)育性狀觀察，并進行果實產(chǎn)量統(tǒng)計和品質(zhì)分析。參照王武等（2013）的方法，選取生長勢一致的5株健康試驗樹，于果實成熟期在每株樹的樹冠外圍中部隨機采摘6個果實，合計30個果實，帶回實驗室備用。參照出口柑橘鮮果檢驗方法（GB/T 8210-1987）要求進行果品分析，其中，可溶性固形物含量采用數(shù)顯PAL-1測糖儀測定，可滴定酸含量采用NaOH指示劑法測定，維生素C（Vc）含量采用2，6-二氯靛酚滴定法測定。

平均產(chǎn)量（kg/ha）=平均單株產(chǎn)量（kg/株）×實際

株數(shù)（株/ha）

1. 4 統(tǒng)計分析

利用GeneScan讀取電泳檢測獲得的指紋圖譜，以NTSYS-pc 2.1對讀取的數(shù)據(jù)進行分析，利用Dice相似系數(shù)進行計算，得到相似系數(shù)矩陣和聚類分析圖；果品分析數(shù)據(jù)采用Excel 2010和DPS v14.10進行統(tǒng)計分析，以 t 測驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 倍性分析結果

倍性分析結果表明，試驗樹的倍性與早花檸檬相同，均為二倍體樣本（圖1）。說明大果沙糖橘與沙糖橘在倍性上無差異，均為二倍體，其單果重增加不是因為倍性增加所致，與華南農(nóng)業(yè)大學選育的四倍體沙糖橘差異明顯。

2. 2 AFLP選擇性擴增結果

從64對AFLP引物中篩選出8對重復性好、條帶清晰的引物，對供試柑橘材料的基因組DNA進行擴增（圖2），8對引物共擴增出791條清晰條帶，每對引物擴增條帶數(shù)為49～171條，平均每對引物擴增條帶數(shù)為98.88條，其中多態(tài)性條帶709條，多態(tài)性比例為89.63%（表1），說明8對引物能很好地將大果沙糖橘與其他柑橘材料區(qū)分開來。

2. 3 相似系數(shù)及聚類分析

從表2可看出，供試材料兩兩間遺傳相似系數(shù)為0.5121～0.6434，其中大果沙糖橘與沙糖橘的Dice相似系數(shù)為0.6434，說明其親緣關系較近，沙糖橘與春甜橘的Dice相似系數(shù)為0.5121，說明其親緣關系較遠；以0.5640為相似系數(shù)的閾值，可將供試材料分為3類（圖3），其中廣蜜橘和南豐蜜桔歸為一類，桂青橘1號、大果沙糖橘、青皮橘和春甜橘歸為一類，沙糖橘歸為一類。鑒于大果沙糖橘與沙糖橘的親緣關系最近（Dice相似系數(shù)為0.6434），與春甜橘的親緣關系最遠（Dice相似系數(shù)為0.5202），因此可認定大果砂糖橘是不同于其他柑橘材料的變異新種質(zhì)。

2. 4 大果沙糖橘的植物學和生物學特性

觀測發(fā)現(xiàn)，大果沙糖橘成年結果樹株高3.5～4.5 m，樹冠呈圓頭形，樹勢較旺，半開張，冠幅2.8 m×3.5 m，主干光滑，深褐色；枝條長21.0～61.0 cm，平均41.0 cm，徑粗2.9～5.5 mm，平均3.8 mm，刺較少且不明顯；葉片卵圓形，長7.0～9.5 cm，寬4.0～6.0 cm，葉色濃綠，老葉葉尖鈍圓，嫩葉葉尖漸尖，尖部較長，葉緣鋸齒狀，波浪不明顯，翼葉線形而明顯；花為完全花，白色，花瓣5瓣，長橢圓形，先端反卷，花徑1.4～3.0 cm，花藥15個，雌蕊同雄蕊等高或稍高，子房淺綠色，近圓形。

在廣西崇左地區(qū)，大果沙糖橘幼齡樹枝梢一年抽發(fā)5次，分別為春梢1次，夏梢2次，秋梢1次，冬梢1次，成年結果樹枝梢一年抽發(fā)3次，分別為春梢1次，夏梢1次，秋梢1次。春梢萌芽期在2月上、中旬，夏梢在5月中旬，秋梢在8月上、中旬。1年生秋梢或晚夏梢是主要的結果母枝，1年生老熟的春梢和夏梢也可成為結果母枝，以25.0～50.0 cm的枝梢為理想的結果母枝長度。初花期在3月上旬，盛花期在3月中旬，末花期在3月下旬～4月上旬，果實成熟期在12月。

2. 5 果實產(chǎn)量測定和品質(zhì)分析

2013～2016年測產(chǎn)結果，大果沙糖橘產(chǎn)量分別為136425、115961、129603和143246 kg/ha，平均131309 kg/ha；果實扁圓形，果形指數(shù)0.76，單果重53.0～90.0 g。大果沙糖橘果皮橙黃至橙紅色，油胞明顯，較沙糖橘果皮粗糙，肉質(zhì)爽脆，汁多化渣，高糖低酸，風味佳。平均單果重69.0 g，顯著高于沙糖橘79.2%（P<0.05，下同）；平均縱徑（40.7 mm）和橫徑（53.4 mm）也顯著大于沙糖橘，果皮厚度（2.5 mm）、可食率（74.4%）、可溶性固形物含量（13.0%）、可滴定酸含量（0.28%）和Vc含量（33.2 mg/100 gFW）與沙糖橘無顯著差異（P>0.05）（表4）。

3 討論

流式細胞儀倍性分析技術已應用于常規(guī)雜交育種（解凱東等，2014）、原生質(zhì)體融合（陳智煒，2016）、體細胞融合（張亞莎，2016）及組織再生（王子成和李忠愛，2007；阮氏雪，2011）材料的倍性鑒定。本研究中崇左市左江華僑農(nóng)場引種的大果沙糖橘平均單果重為69.0 g，與廣東東莞市清溪鎮(zhèn)大面積栽培的四倍體沙糖橘單果重72.8 g相當（甘廉生和唐小浪，2013），利用流式細胞儀倍性分析技術鑒定其屬于二倍體，與四倍體沙糖橘差異明顯。

AFLP作為一種檢測DNA多態(tài)性的高效分子標記已被廣泛應用于果樹的遺傳多樣性和親緣關系鑒定、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構建、基因標記及輔助育種選擇（吳俊等，2004）。王平等（2012）利用AFLP技術進行遺傳差異分析發(fā)現(xiàn)，廣東省新選育16個柑橘優(yōu)良品系（株系）的遺傳基礎均發(fā)生了不同程度的變化。傅翠娜等（2014）研究表明，選用12對AFLP引物組合對金柑資源進行遺傳多樣性分析和分類，能很好地將8份金柑資源區(qū)分開來。本研究結果表明，采用8對AFLP引物組合可將大果沙糖橘與沙糖橘、廣蜜桔、南豐蜜桔、桂青橘1號、青皮橘和春甜橘等柑橘品種在分子水平上進行區(qū)分，說明利用AFLP分子標記檢測柑橘芽變等變異材料有效。

大果沙糖橘的枝條明顯長于沙糖橘，葉片明顯大于沙糖橘，花的大小與沙糖橘一致（甘廉生和唐小浪，2013），單果重顯著重于沙糖橘，發(fā)芽抽梢、開花結果和果實成熟等物候期與沙糖橘一致。

近年來，廣西地區(qū)柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，可實現(xiàn)柑果周年上市，產(chǎn)量從2010年的349萬t增加到2015年的472萬t，從當年7月的特早熟溫州蜜柑到次年6月的夏橙，每月均有柑橘上市（袁琳和王舉兵，2016）。其中，沙糖橘的種植面積和產(chǎn)量均居廣西各柑橘品種首位，但其成熟期為12月，是柑橘集中大量上市時期。本研究鑒定的大果沙糖橘穩(wěn)產(chǎn)豐產(chǎn)，品質(zhì)上乘，成熟期與沙糖橘一致，具有一定的市場競爭優(yōu)勢，但尚不能進行產(chǎn)期調(diào)控，因此，還應繼續(xù)挖掘大果沙糖橘的潛在價值，以期選育出熟期存在差異的沙糖橘新品系（種）。

4 結論

大果沙糖橘是具有遺傳特異性的二倍體柑橘種質(zhì)資源，單果重較沙糖橘高，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，口感與沙糖橘相當，味甜，汁多，適宜在廣西沙糖橘產(chǎn)區(qū)推廣種植。

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（責任編輯 思利華）