朱玉璞 劉璐 徐曉白 曲正陽 李志娟 李彬 王麟鵬

摘要目的：研究電針對電刺激硬腦膜大鼠偏頭痛內(nèi)源性大麻素及其分解酶活性的調(diào)節(jié)作用。方法：成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，對照組、模型組、單穴組和假穴組。實(shí)驗第9天取大鼠頸靜脈血清，用酶聯(lián)免疫吸附測定測定AEA、2AG、MAGL、FAAH，結(jié)果：與模型組比較，單穴組AEA含量提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），MAGL含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）；與對照組比較，模型組AEA含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），MAGL含量提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）；與假穴組比較，單穴組AEA含量提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），MAGL含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）；各組大鼠血清FAAH和2AG含量無顯著變化。結(jié)論：提示電針對偏頭痛大鼠模型的內(nèi)源性大麻素及其分解酶具有調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞針刺；偏頭痛；大鼠；炎癥湯；內(nèi)源性大麻素；分解酶

Regulation Effects of Electroacupuncture on Endogenous Cannabinoid and Its Catabolic Enzyme Activity in Migraine Rats

Zhu Yupu1， Liu Lu2， Xu Xiaobai2， Qu Zhengyang2， Li Zhijuan1，2， Li Bin2， Wang Linpeng2

（1 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100010， China）

AbstractObjective：To study the regulation effects of electroacupuncture on endogenous cannabinoid and its catabolic enzyme activity in migraine rats. Methods：Adult male SD rats were randomly divided into 4 groups：control group， model group， single acupoint group and false acupoint group. Rat jugular vein serum was taken on the 9th day of the experiment， and AEA， 2AG， MAGL， FAAH were determined by enzymelinked immunosorbent assay. Results：Compared with the model group， the content of AEA in the single acupoint group was increased （P<005） and the content of MAGL was decreased （P<005）. Compared with the control group， the content of AEA in the model group decreased （P<005）， and the content of MAGL in the model group increased （P<005）. Compared with the sham acupoints group， the content of AEA in the single acupoint group was increased （P<005） and the content of MAGL was decreased in the single acupoint group （P<005）. The content of FAAH and 2AG in serum of rats in each group had no significant changes. Conclusion：It suggests that the endogenous cannabinoids and their degrading enzymes have a regulatory effect on the migraine rat model.

Key WordsElectroacupuncture； Migraine； Rats； Endogenous cannabinoid； Enzyme

中圖分類號：R245文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.040

偏頭痛是一種病因不明、反復(fù)發(fā)作、致殘性的神經(jīng)功能紊亂疾病，發(fā)病時頭部單側(cè)搏動樣中重度劇烈疼痛，同時伴有畏光畏聲、惡心嘔吐等癥狀[1]。據(jù)2017年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）全球疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查[2]顯示，偏頭痛的全球健康壽命損失年在所有疾病當(dāng)中排名第3，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病失能調(diào)整生命年中占比131%，僅次于中風(fēng)。隨著研究的進(jìn)展，人們對偏頭痛的認(rèn)識正逐步加深，但是偏頭痛的發(fā)病機(jī)制仍不明確，目前最為公認(rèn)的學(xué)說是三叉神經(jīng)血管學(xué)說。

大麻是廣為人知的天然鎮(zhèn)痛物質(zhì)，18世紀(jì)人們就已經(jīng)將大麻作為治療偏頭痛的藥物[3]。現(xiàn)代研究表明內(nèi)源性大麻素（Endocannabinoids，eCBs）系統(tǒng)具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用，可以介導(dǎo)多種疾病的病理過程[4]。在20世紀(jì)末，人們找到了第一種“類大麻素樣物質(zhì)”N花生四烯酸乙醇胺（Anandamide，AEA），具有與△9四氫大麻酚（△9tetrahydrocannabinol，THC）相似的生物學(xué)效應(yīng)，此后人們又發(fā)現(xiàn)了2花生四烯酸甘油（2arachidonic acid，2AG），從此人們對eCBs系統(tǒng)有了新的認(rèn)識。

針灸作為傳統(tǒng)中醫(yī)療法正逐漸被國內(nèi)外所接受，在疼痛疾病方面具有優(yōu)勢[5]。有臨床研究表明針刺治療可以提高偏頭痛發(fā)作天數(shù)減半率[6]。同時，美國神經(jīng)協(xié)會認(rèn)可了針灸在偏頭痛治療中的作用[7]。WHO也已經(jīng)將“偏頭痛”列入針灸治療疾病的推薦疾病譜[8]。現(xiàn)代研究當(dāng)中，多數(shù)學(xué)者關(guān)注針刺對內(nèi)源性大麻素受體（Cannabinoid Receptor，CBR）的調(diào)節(jié)，對eCBs及其分解酶的關(guān)注不多。因此本文試圖探討針刺在對eCBs的釋放和分解的干預(yù)在鎮(zhèn)痛機(jī)制當(dāng)中的作用，從而發(fā)現(xiàn)針刺治療偏頭痛的新機(jī)制。

1材料與方法

11材料

111動物成年雄性SD大鼠24只，體重200～220 g，由軍科院提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，單籠喂養(yǎng)，12：12 h明暗交替模擬晝夜。大鼠隨機(jī)分為4組，即：對照組（C，只進(jìn)行手術(shù)，不進(jìn)行炎癥湯注射）、模型組（M，炎癥湯注射造模不給予電針）、單穴組（EA，造模并給予電針風(fēng)池）和假穴組（NA，造模并給予電針假穴），每組6只。

12方法手術(shù)操作：用10%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，大鼠備皮后置于腦立體定位儀上，并固定住頭部。消毒后大鼠頭頂部沿正中線，逐層剪開組織徹底暴露顱骨。以大鼠顱骨前囟為原點(diǎn)，向左向前各1 mm處打穿顱骨。將套管放入鉆孔中，用螺絲和牙科水泥進(jìn)行固定。最后向套管內(nèi)注射肝素鈉封管。在大鼠下肢肌肉注射1 mL慶大霉素，待大鼠清醒后放回籠舍，手術(shù)后大鼠正常飼養(yǎng)恢復(fù)1周。

清醒狀態(tài)下反復(fù)注射炎癥湯：大鼠術(shù)后恢復(fù)后，將大鼠固定于特制的大鼠固定裝置上，用微量注射泵以2 μL/min泵入20 μL炎癥湯后封管。在實(shí)驗第1、3、5、7、9 d注射炎癥湯，對照組大鼠等速等量注射人工腦脊液。

配制炎癥湯：組胺、5羥色胺和緩激肽，均為2 mM，和前列腺素E2（PGE2），分別為02 mmol，溶于pH50的10 mmol HEPES緩沖液中。

121電針治療電針穴位選取參照《實(shí)驗針灸學(xué)》[9]，單穴組取大鼠雙側(cè)“風(fēng)池”穴（GB20），雙穴組取大鼠雙側(cè)“陽陵泉”穴（GB34）。假穴取風(fēng)池穴旁開1 mm。在實(shí)驗第1、3、5、7、9 d進(jìn)行電針治療。電針（直徑016 mm）進(jìn)針約2～3 mm，連接華佗牌電針儀，電針參數(shù)：疏密波2 Hz，1～2 mA，強(qiáng)度以大鼠耳郭輕度抖動或局部肌肉收縮為度，電針治療10 min。

122取材與ELISA檢測取材在實(shí)驗第9天進(jìn)行，實(shí)驗結(jié)束后用10%水合氯醛03 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠并以仰臥位固定。暴露大鼠雙側(cè)頸靜脈，抽取1～2 mL大鼠頸靜脈血并加入50 μL抑肽酶。離心機(jī)4 ℃、3 000 r/min離心15 min后取上清備用。利用ELISA法檢測大鼠血清AEA、2AG、MAGL、FAAH含量，ELISA檢測嚴(yán)格遵照試劑盒說明書進(jìn)行。

13統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 100統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所得實(shí)驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析法對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

實(shí)驗結(jié)果顯示，大鼠血清中AEA的含量M組（862±092）顯著低于C組（1335±143），且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0001），EA（1173±058）組高于NA（1010±090）組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<001），EA（1173±058）組高于M（862±092）組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0001），NA組和M組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

實(shí)驗結(jié)果顯示，大鼠血清中MAGL的含量M組（1 02658±1491）ng/mL顯著高于C組（82372±6122）ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<001），EA（71115±10907）ng/mL組低于NA（98586±698）ng/mL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），EA（71115±10907）ng/mL組低于M（1 02658±1491）ng/mL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0001），NA組和M組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>005）。

此外，實(shí)驗各組大鼠血清中2AG和FAAH含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>005）。

3討論

偏頭痛是一種常見的神經(jīng)內(nèi)科疾病，遷延難愈且具有致殘性和遺傳傾向。本病至今發(fā)病機(jī)制并不明確，目前關(guān)于偏頭痛的發(fā)病機(jī)制有神經(jīng)學(xué)說、遺傳學(xué)說及離子學(xué)說等多種學(xué)說，其中三叉神經(jīng)血管學(xué)說是目前較為公認(rèn)的學(xué)說。偏正頭痛中醫(yī)理論中均屬于頭風(fēng)病，偏頭痛是頭風(fēng)病的一種，其病屬少陽經(jīng)，本實(shí)驗選穴風(fēng)池是足少陽膽經(jīng)要學(xué)，可祛風(fēng)散寒，治療頭痛、眩暈等頭部諸疾。

目前常用的大鼠炎癥湯偏頭痛模型主要有完全弗氏佐劑和配方炎癥湯2類。本實(shí)驗?zāi)Ｐ筒捎糜材X膜上反復(fù)配方注射炎癥湯模型來模擬大鼠偏頭痛發(fā)作。有文獻(xiàn)報道稱，反復(fù)向大鼠硬腦膜注射炎癥湯可以誘發(fā)大鼠的偏頭痛發(fā)作[10]。在硬腦膜上注射炎癥湯后15 min可明顯觀察到硬腦膜血管擴(kuò)張[11]。同時，注射炎癥湯可以引發(fā)大鼠的中樞敏化和外周敏化，降低大鼠痛域。以上均說明硬腦膜上注射炎癥湯是一種可靠的偏頭痛動物造模方法。

在eCBs以及“類內(nèi)源性大麻素樣物質(zhì)”中，AEA和2AG是目前研究最為深入的2種eCBs。AEA和2AG是2種“即時分泌”的逆行神經(jīng)遞質(zhì)[12]，AEA和2AG在突觸后膜分泌，作用于突觸前膜的CBR，產(chǎn)生效應(yīng)后立即被重新攝入到神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)被eCBs分解酶分解。eCBs分解酶主要有2種，分別為脂肪酰胺水解酶（Fatty Acid Amide Hydrolase，F(xiàn)AAH）和單?；视王ッ福∕onoacylglycerol Lipase，MAGL），這2種分解酶分別對應(yīng)分解AEA和2AG。隨著研究的進(jìn)展，人們試圖通過開發(fā)分解酶抑制來降低eCBs的分解，從而研發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物。目前有學(xué)者針對eCBs分解酶開發(fā)新的抗偏頭痛藥物，發(fā)現(xiàn)當(dāng)給MAGL基因敲除小鼠注射硝酸甘油時會引發(fā)小鼠的偏頭痛樣疼痛[13]。

本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)電針治療可以有效干預(yù)偏頭痛大鼠體內(nèi)eCBs及其分解酶的含量。實(shí)驗數(shù)據(jù)表明，大鼠血清中AEA含量M組比C組明顯降低，MAGL含量M組比C組明顯升高，說明偏頭痛造模成功，同時說明偏頭痛發(fā)作期間可以觀察到大鼠eCBS系統(tǒng)有相應(yīng)的變化。有研究表明，AEA可抑制偏頭痛大鼠的痛覺過敏[14]。另外，MAGL基因敲除偏頭痛小鼠出現(xiàn)了痛域下降[13]，這揭示當(dāng)偏頭痛發(fā)作時有eCBs及其分解酶的變化。本實(shí)驗中大鼠血清中AEA含量EA組比M組明顯升高，MAGL含量EA組比M組明顯降低，可以說明針刺可以干預(yù)偏頭痛大鼠源性大麻素分解酶，從而預(yù)防偏頭痛發(fā)作。此外，大鼠血清中AEA含量NA組比EA組有降低，且MAGL升高，可以說明經(jīng)穴和非經(jīng)假穴在預(yù)防偏頭痛發(fā)作方面具有療效差異。另外，各組大鼠比較，F(xiàn)AAH和2AG 2個指標(biāo)并差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明電針預(yù)防偏頭痛發(fā)作并非依靠該2者起作用。出現(xiàn)該結(jié)果可能是電針增加AEA的分泌反射性的引起FAAH的升高，同時，電針激活了分解酶MAGL，所以2AG的含量有所下降。

本實(shí)驗在技術(shù)選擇上只選用了ELISA一種技術(shù)進(jìn)行驗證，同時也未觀察大鼠具體腦核團(tuán)的eCBs及其分解酶的含量，以上是該實(shí)驗存在的不足之處，我們將在未來的實(shí)驗中進(jìn)一步深入探討。

參考文獻(xiàn)

[1]Burstein R，Noseda R，Borsook D.Migraine：multiple processes，complex pathophysiology[J].J Neurosci，2015，35（17）：66196629.

[2]Steiner TJ，Stovner LJ，Vos T.GBD 2015：migraine is the third cause of disability in under 50s[J].J Headache Pain，2016，17（1）：104.

[3]Baron EP.Comprehensive Review of Medicinal Marijuana，Cannabinoids，and Therapeutic Implications in Medicine and Headache：What a Long Strange Trip It′s Been [J].Headache，2015，55（6）：885916.

[4]Ryz NR，Remillard DJ，Russo EB.Cannabis Roots：A Traditional Therapy with Future Potential for Treating Inflammation and Pain[J].Cannabis Cannabinoid Res，2017，2（1）：210216.

[5]Li Z，Liu M，Lan L，et al.Altered periaqueductal gray resting state functional connectivity in migraine and the modulation effect of treatment[J].Sci Rep，2016，6：20298.

[6]Wang LP，Zhang XZ，Guo J，et al.Efficacy of acupuncture for migraine prophylaxis：a singleblinded，doubledummy，randomized controlled trial[J].Pain，2011，152（8）：18641871.

[7]Campbell JK，Penzien DB.EvidencedBased Guidelines For Migraine Headache：Behavioral and Physical Treatments[J].US Headache Consortium 1：129，2000，1：129.

[8]von Peter S，Ting W，Scrivani S，et al.Survey on the use of complementary and alternative medicine among patients with headache syndromes[J].Cephalalgia，2002，22（5）：395400.

[9]郭義，方劍喬.實(shí)驗針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2012：51212.

[10]Nelly Boyera B，Radhouane Dallela B C，Alain Artolaa B，et al.General trigeminospinal central sensitization and impaired descending pain inhibitory controls contribute to migraine progression[J].Pain，2014（7）：11961205.

[11]Lundblad C，Haanes KA，Grande G，et al.Experimental inflammation following dural application of complete Freund′s adjuvant or inflammatory soup does not alter brain and trigeminal microvascular passage[J].J Headache Pain，2015，16（1）：19.

[12]Chiurchiù V，dSM Van，Centonze D，et al.The endocannabinoid system and its therapeutic exploitation in multiple sclerosis：Clues for other neuroinflammatory diseases[J].Prog Neurobiol，2017，160：82100.

[13]Nozaki C，Markert A，Zimmer A.Inhibition of FAAH reduces nitroglycerininduced migrainelike pain and trigeminal neuronal hyperactivity in mice[J].Eur Neuropsychopharmacol，2015，25（8）：13881396.

[14]Greco R，Mangione A S，Sandrini G，et al.Effects of anandamide in migraine：data from an animal model[J].J Headache Pain，2011，12（2）：177183.