紀(jì)雯婷　胡京紅　于雪　范盎然　任紅　張?zhí)m蘭　劉敏

摘要 目的：研究麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞24 h后，樹突狀細(xì)胞STAT6磷酸化程度（pSTAT6）及其STAT6 mRNA、IL-4 mRNA、IFN-γ mRNA表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，7 d后收集細(xì)胞，用麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)24 h，收集細(xì)胞，檢測(cè)IL-4、IL-5和IL-13的含量，pSTAT6的表達(dá)、檢測(cè)IL-4 mRNA、STAT6 mRNA、GATA-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞后降低IL-4（P<0.05）、IL-13（P<0.01）的含量，對(duì)IL-5的分泌影響不大，pSTAT6的表達(dá)下降（P<0.01）；IL-4 mRNA、STAT6 mRNA，以及GATA-3 mRNA表達(dá)降低（P<0.01）結(jié)論：麻黃細(xì)辛附子湯能調(diào)控IL-4/STAT6通路，調(diào)節(jié)Th2調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡，減輕了變應(yīng)性炎性反應(yīng)的發(fā)生，可對(duì)過敏性鼻炎發(fā)揮治療作用。

關(guān)鍵詞 樹突狀細(xì)胞；麻黃細(xì)辛附子湯；STAT6；Th1/Th2

Abstract Objective：To study the effects on phosphorylation （pSTAT6） level of signal transducer and activator of transcription 6 （STAT6） and the expressions of andSTAT6 mRNA，IL-4 mRNA，IFN-γ mRNA of dendritic cells （DCs） after the 24 h interference of Mahuang Xixin Fuzi Decoction on DCs.Methods：The dendritic cells deriving from mouse bone marrow after 7 days culture in vitro were collected，then the DCs for 24 h were interfered with Mahuang Xixin Fuzi Decoction.The cells were collected and the contents of IL-4，IL-5 and IL-13 and the expressions of pSTAT6，IL-4 mRNA，STAT6 mRNA，GATA-3 mRNA were detected.Results：The contents of IL-4 （P<0.05） and IL-13 （P<0.01） was reduced after intervention of Mahuang Xixin Fuzi Decoction.There was no significant difference in content of IL-5 compared with the blank control group.The expressions of pSTAT6 decreased （P<0.01） and the expression of IL-4 mRNA，STAT6 mRNA，GATA-3 mRNA was decreased （P<0.01）.Conclusion：Mahuang Xixin Fuzi Decoction could control the pathway of IL-4/STAT6 signal transduction and regulate the imbalance of Th1/Th2 and play a vital role in the treatment of allergic rhinitis.

Key Words Dendritic cells； Mahuang Xixin Fuzi Decoction； STAT6； Th1/Th2

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.043

麻黃細(xì)辛附子湯出自《傷寒論》，由麻黃、細(xì)辛、附子3味藥組成，臨床上常用于過敏性鼻炎、哮喘等疾病，收效顯著[1-3]。過敏性鼻炎為Th2優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答的炎性反應(yīng)[4-6]，其發(fā)生與Th1/Th2的偏移密切相關(guān)。樹突狀細(xì)胞是重要的抗原提呈細(xì)胞，是免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者，對(duì)Th細(xì)胞的分化密切相關(guān)。本文通過麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞的干預(yù)研究，探討麻黃細(xì)辛附子湯治療過敏性鼻炎可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 C57BL/6雄性小鼠6周齡（20±5）g購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，全部小鼠在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心三級(jí)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室溫度為（22±2）℃，濕度60%±5%，正常光照晝夜節(jié)律，維持安靜環(huán)境。

1.1.2 藥物 實(shí)驗(yàn)選用的麻黃細(xì)辛附子湯出自《傷寒論》，麻黃、細(xì)辛、附子均購于北京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂。

1.1.3 試劑與儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher scientific公司），離心機(jī)（Eppendorf公司），F(xiàn)CS、RPMI1640培養(yǎng)基為GBICO公司產(chǎn)品，GM-CSF、IL-4來自R&D公司，STAT6抗體購于Proteintech group公司，pSTAT6抗體來自abcam，Aimplex流式高通量檢測(cè)試劑盒（北京曠博生物技術(shù)股份有限公司），IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3mRNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞的分離培養(yǎng) C57BL/6J小鼠分離培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[7-8]具體過程為：無菌條件下將小鼠股骨與脛骨分離，用1 mL注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液從打孔處將骨髓沖入到干燥無菌培養(yǎng)皿中，收集骨髓細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，將細(xì)胞重懸于含GM-CSF、IL-4的完全培養(yǎng)基中，密度為2×106個(gè)/mL，種于6孔板中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天半換液，第6天時(shí)收集細(xì)胞備用。

1.2.2 藥物制備與篩選

1.2.2.1 麻黃細(xì)辛附子湯水提液制備 麻黃細(xì)辛附子湯，常用量為麻黃6 g、附子9 g、細(xì)辛3 g，用超純水按比例煎煮藥物1 h，使藥物終濃度達(dá)1 g/mL。12 000 r/min高速離心2次，10 min/次，收集上清，用0.22 μm的微孔濾器過濾除菌并分裝，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)濃度的篩選 為了篩選適宜濃度的麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞，收集分選的樹突狀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105，吹打均勻，加入96孔板，每孔100 μL，10倍稀釋等比例稀釋1 g/mL的麻黃附子細(xì)辛湯水提液，按順序加入96空中，每個(gè)濃度的水提液設(shè)6個(gè)復(fù)孔，把細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK8試劑，酶標(biāo)儀測(cè)試1次/0.5 h，并記錄數(shù)據(jù)。調(diào)整水提液濃度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)10 mg/mL以內(nèi)的麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)樹突狀細(xì)胞的毒性很小，實(shí)驗(yàn)選擇麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)濃度為2 mg/mL。

1.2.3 分組與給藥 本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)空白對(duì)照組（C組）與麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)組（M組）。其中，M組用麻黃細(xì)辛附子湯（2 mg/mL）干預(yù)24 h，C組用完全培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)24 h。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.4.1 樹突狀細(xì)胞IL-4、IL-5、IL-13的檢測(cè) 培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞，按2×105種于24孔板，0.5 mL/孔。各組分別干預(yù)24 h后，收集各組細(xì)胞上清，按照Aimplex流式高通量多因子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)各組樹突狀細(xì)胞上清中IL-4、IL-13與IL-5的含量。

1.2.4.2 樹突狀細(xì)胞STAT6磷酸化的表達(dá)的檢測(cè) 培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞，按5×106種于6孔板，2 mL/孔。各組分別干預(yù)24 h后，分別收集各組細(xì)胞，檢測(cè)STAT6與pSTAT6蛋白表達(dá)水平。

1.2.4.3 樹突狀細(xì)胞表達(dá)IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA 制備并分選樹突狀細(xì)胞，按2×105種于24孔板，0.5 mL/孔。各組分別干預(yù)24 h后，分別收集各組細(xì)胞，熒光定量PCR法檢測(cè)各組IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA表達(dá)。見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各種計(jì)量資料以（±s）表示。多組采用單因素方差分析，SNK兩兩比較；2組比采用獨(dú)立t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GM-CSF、IL-4成功誘導(dǎo)單核骨髓細(xì)胞成為樹突狀細(xì)胞 小鼠骨髓單核細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4的刺激下，成功誘導(dǎo)成為樹突狀細(xì)胞。顯微鏡下觀測(cè)可知，誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞成葡萄串樣生長(zhǎng)，細(xì)胞有毛刺樣突起。見圖1。

2.2 麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞分泌IL-4與IL-13減少，而IL-5的含量沒有明顯變化 IL-4，IL-5以及IL-13均是典型的Th2型細(xì)胞因子。麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞24 h后，樹突狀細(xì)胞分泌IL-4的含量減少（P<0.05），分泌IL-13的含量也顯著降低（P<0.01），而IL-5的的含量與空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2，圖2。可見，麻黃細(xì)辛附子湯可直接選擇性降低Th2相關(guān)的細(xì)胞因子，起到抑制過敏性炎性反應(yīng)的作用。

2.3 麻黃細(xì)辛附子湯降低樹突狀細(xì)胞pSTAT6/STAT6比值 麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞24 h后，樹突狀細(xì)胞表達(dá)STAT6水平較空白對(duì)照組無差異，而pSTAT6的表達(dá)明顯降低（P<0.01），pSTAT6/STAT6比值降低（P<0.05）。見圖3、圖4。可見麻黃細(xì)辛附子湯能抑制STAT6磷酸化的水平從而阻止了T細(xì)胞Th2方向分化，起到調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡的作用。

2.4 麻黃細(xì)辛附子湯降低樹突狀細(xì)胞IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA的表達(dá) IL-4/STAT6通路是經(jīng)典的Th2激活通路，通過細(xì)胞因子以及蛋白表達(dá)結(jié)果可知，麻黃細(xì)辛附子湯可降低IL-4水平，減少STAT6的磷酸化表達(dá)，我們進(jìn)一步通過mRNA水平驗(yàn)證麻黃細(xì)辛附子湯在樹突狀細(xì)胞上的抗炎機(jī)制。麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞24 h后，樹突狀細(xì)胞IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3 mRNA的表達(dá)均較空白對(duì)照組明顯降低（P<0.01）。見表3，圖5?？梢?，麻黃細(xì)辛附子湯可通過調(diào)控IL-4 mRNA，STAT6 mRNA以及GATA-3mRNA發(fā)揮抗過敏的作用。

3 討論

過敏性鼻炎作為TH2優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答的炎性反應(yīng)，其臨床特點(diǎn)為鼻癢、噴嚏、流涕、多遇寒而犯、遷延時(shí)長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作，過敏性鼻炎貌似“外感”，實(shí)為“內(nèi)傷”，通過傳統(tǒng)中醫(yī)思維的辨證分析，可以看出氣虛陽衰而外感寒邪是過敏性鼻炎關(guān)鍵病機(jī)[9-10]。麻黃細(xì)辛附子湯配伍嚴(yán)謹(jǐn)，將扶陽，散陽，通陽3個(gè)方面結(jié)合在一起，能扶正祛表，表里兼治，具有治療過敏性鼻炎的理論基礎(chǔ)[11-12]。

樹突狀細(xì)胞是抗原提呈細(xì)胞中攝取提呈抗原能力最強(qiáng)的成員，處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。樹突狀細(xì)胞能活化T細(xì)胞，分泌各種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)并促進(jìn)活化的T細(xì)胞分化，對(duì)Th分化起著重要的調(diào)控作用[13-14]。其中，樹突狀細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子如IL-12及IFN-γ等，誘導(dǎo)T細(xì)胞向T細(xì)胞向Th1方向分化[15]。同時(shí)，樹突狀細(xì)胞也可IL-4及IL-13等Th2型細(xì)胞因子，誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2方向偏移，造成過敏性疾病的發(fā)生[16]。麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞之后，引起IL-4與IL-13的分泌的減少，可起到調(diào)節(jié)Th2分化，改善過敏性疾病的潛質(zhì)。但麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)IL-5的含量影響不大，說明麻黃細(xì)辛附子湯可選擇性的影響Th2型細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞因子上游具有特殊的調(diào)節(jié)作用。

信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（Signal Transducers and Activators of Transcription，STAT）是一類具有信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化的胞質(zhì)蛋白家族，其家庭成員包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6[17-18]。STAT6可被IL-4、IL-13激活，活化后的STAT6進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-4、IL-13等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，促進(jìn)IL-4、IL-13等TH2型細(xì)胞因子的分泌，加重了TH2型炎性反應(yīng)的發(fā)生[15-16，19-22]。因此，STAT6作為誘導(dǎo)Th2型變應(yīng)性炎性反應(yīng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，增加了變應(yīng)性炎性反應(yīng)的易感性，在許多過敏性疾病中都引起了研究者們重視。麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞后，STAT6磷酸化水平減少，從而阻止了T細(xì)胞Th2方向偏移，調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡，起到治療過敏性鼻炎的作用。

GATA-3 mRNA是Th2的特異性轉(zhuǎn)錄因子[23]，作為STAT6的上游[24]，激活后指導(dǎo)T細(xì)胞向Th2方向分化。麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)后樹突狀細(xì)胞IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3 mRNA的表達(dá)均下降，說明麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)Th2經(jīng)典通路IL-4/STAT6具有調(diào)控作用，可發(fā)揮調(diào)節(jié)過敏性鼻炎的作用。

總之，麻黃細(xì)辛附子湯減少IL-4、IL-13分泌，降低pSTAT6水平，降低IL-4 mRNA、STAT6 mRNA及GATAT-3 mRNA含量，負(fù)反饋樹突狀細(xì)胞IL-4/STAT6通路，使樹突狀細(xì)胞抑制T細(xì)胞Th2方向分化，調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡，從而發(fā)揮治療過敏性鼻炎的作用。

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（2017-07-03收稿 責(zé)任編輯：王明）