李濤 程雪嬌 胡美變 劉玉杰 吳純潔

中圖分類(lèi)號(hào) R283 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）07-0968-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.25

摘 要 目的：優(yōu)化蟬蛻蛋白的提取工藝，并考察其體外抗氧化活性，為蟬蛻蛋白的深入研究提供參考。方法：以蛋白提取量為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助提取蟬蛻蛋白的液料比、超聲時(shí)間、提取次數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。以維生素C（VC）為陽(yáng)性對(duì)照，以對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2，2′ -連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基的清除率為指標(biāo)，評(píng)價(jià)蟬蛻蛋白的體外抗氧化活性。結(jié)果：蟬蛻蛋白的最佳提取條件為液料比28 ∶ 1（mL/g），超聲時(shí)間65 min，提取2次。驗(yàn)證試驗(yàn)中，蟬蛻蛋白的平均提取量為65.45 mg/g（RSD=1.68%，n=3），與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為5.48%。蟬蛻蛋白對(duì)ABTS和DPPH自由基均有一定的清除效果，當(dāng)蟬蛻蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)對(duì)ABTS自由基的清除率即達(dá)97.0%，其作用與VC相當(dāng)；蟬蛻蛋白對(duì)DPPH自由基的清除能力稍弱，半數(shù)清除濃度為0.96 mg/mL，其作用不及VC。結(jié)論：采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化蟬蛻蛋白的提取條件準(zhǔn)確、可靠；蟬蛻蛋白具有一定的體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 蟬蛻蛋白；超聲波輔助提??；工藝優(yōu)化；Box-Behnken響應(yīng)面法；體外抗氧化活性

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize extraction technology of protein from Cryptotympana pustulata and investigate its in vitro antioxidant activity， so as to provide reference for further research of protein from C. pustulata. METHODS： Using extraction amount of protein as response value， based on single factor test， Box-Behnken response surface methodology was used to optimize the ratio of liquid to material， ultraonic time and extraction times. Validation test was conducted. Using Vitamin C （VC） as positive control， in vitro antioxidant activity of protein from C. pustulata was evaluated by using scavenging rate of 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） and 2，2′ -azino-bis（3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid） （ABTS） free radical as index. RESULTS： The optimal extraction condition of protein from C. pustulata was as follows as the ratio of liquid to material 28 ∶ 1 （mL/g）， ultrasonic time of 65 min， extracting for twice. In validation test， average extraction amount of protein from C. pustulata was 65.45 mg/g（RSD=1.68%，n=3）， relative error of which to predicted value was 5.48%. The protein from C. pustulata showed strong scavenging effect on ABTS and DPPH free radicals. When the concentration of protein from C. slough was 0.2 mg/mL， and the scavenging rate of it to ABTS free radicals was 97%， the effect of which was similar to VC. The protein from C. pustulata showed weak scavenging ability to DPPH free radical， IC50 was 0.96 mg/mL， the effect of which was not as good as VC. CONCLUSIONS： The extraction technology of protein from C. pustulata optimized by Box-Behnken response surface methodology shows high accuracy and good reliability. The protein from C. pustulata shows certain antioxidant activity in vitro.

KEYWORDS Protein from Cryptotympana pustulata； Ultrasonic assisted extraction； Technology optimization； Box-Behnken response surface methodology； Antioxidant activity in vitro

蟬蛻為蟬科昆蟲(chóng)黑蚱（Cryptotympana pustulata Fabricius）的若蟲(chóng)羽化時(shí)脫落的皮殼，味甘，性寒，入肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、明目退翳、利咽、解痙等功效[1]。蟬蛻屬于臨床用量較大的動(dòng)物藥之一，已有兩千多年的用藥歷史，其既可內(nèi)服也可外用?，F(xiàn)代藥理研究表明，蟬蛻具有解熱、祛痰平喘、抗驚厥、興奮子宮平滑肌和改善血液流變學(xué)等藥理作用[2-4]，因其療效確切且安全性較高，在兒科、神經(jīng)科、五官科等均得到了廣泛的應(yīng)用，主要用于治療小兒夜啼、小兒抽動(dòng)癥、咳嗽、腎炎、產(chǎn)后急性尿潴留等疾病[5-6]。

動(dòng)物藥的主要化學(xué)成分是蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸，近年來(lái)許多學(xué)者對(duì)多種動(dòng)物藥的蛋白質(zhì)展開(kāi)研究，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物藥的蛋白質(zhì)具有多種藥理作用，如抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、降血糖和抗肝纖維化等[7-11]。目前，關(guān)于蟬蛻的現(xiàn)代研究甚少，關(guān)于其研究多集中于氨基酸與微量元素方面，尚未見(jiàn)蟬蛻蛋白質(zhì)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“蟬蛻蛋白”）提取條件優(yōu)化及抗氧化活性的相關(guān)報(bào)道。因此，筆者擬通過(guò)超聲波輔助提取蟬蛻蛋白，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并對(duì)最優(yōu)條件提取的蟬蛻蛋白進(jìn)行體外抗氧化活性研究，為蟬蛻蛋白的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；PHS-3C精密酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；DB-206SC電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（成都天宇試驗(yàn)設(shè)備有限責(zé)任公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

蟬蛻飲片購(gòu)自成都岷江源藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：20160810，產(chǎn)地：四川），經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為蟬科昆蟲(chóng)黑蚱的若蟲(chóng)羽化時(shí)脫落的皮殼；維生素C（VC，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2015121901，純度：>99.7%）；牛血清白蛋白（上海伯奧生物科技有限公司，批號(hào)：090165，純度：>99.0%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：D9132，純度：>97%）；2，2′ -連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（ABTS，上海美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：D1220A，純度：>99%）；甲醇、乙醇、石油醚（沸點(diǎn)：30～60 ℃）、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、過(guò)硫酸鉀等試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 蛋白含量的測(cè)定

以牛血清白蛋白為對(duì)照品，采用福林酚法[12]測(cè)定樣品中蛋白含量。堿性銅試液的制備：分別稱(chēng)取碳酸鈉10 g、氫氧化鈉2 g和酒石酸鉀鈉0.25 g，溶于500 mL水中，作為A液；再稱(chēng)取硫酸銅0.5 g，溶于100 mL水中，作為B液；將A液與B液按50 ∶ 1的體積比混勻，即得。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取牛血清白蛋白15.0 mg，精密稱(chēng)定，置于25 mL量瓶中，加水定容至刻度，即得0.6 mg/mL的牛血清白蛋白對(duì)照品溶液。分別精密量取上述對(duì)照品溶液0、1、2、3、4、5 mL至5 mL的量瓶中，加水定容至刻度，即得不同質(zhì)量濃度（0.00、0.12、0.24、0.36、0.48、0.60 mg/mL）的對(duì)照品溶液。精密量取各質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液1.0 mL，分別置于具塞試管中，分別加入堿性銅試液5.0 mL，搖勻，室溫靜置10 min后，向各試管中加入福林酚試液（取2 mol/L 福林酚試劑1 mL，加水至2 mL）0.5 mL，立即混勻，室溫放置30 min，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于650 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL）、吸光度為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.011 1x+0.061 9（r2=0.999 8），表明牛血清白蛋白檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.12～0.60 mg/mL。

2.1.2 樣品中蛋白含量的測(cè)定 取蟬蛻適量，置于40 ℃烘箱中烘干，粉碎過(guò)三號(hào)篩，室溫條件下按6 ∶ 1（V/m，mL/g）的液料比加入石油醚脫脂3次，每次1 h。脫脂后揮干石油醚，40 ℃干燥，即得蟬蛻脫脂粉末。精密稱(chēng)取蟬蛻脫脂粉末2 g，置于錐形瓶中，按一定液料比加入75%乙醇，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至10，超聲提?。ǔ暪β蕿?00 W，頻率為40 kHz）一定的時(shí)間和次數(shù)，提取液濾過(guò)，濾液置于250 mL量瓶中，加水定容至刻度，按照“2.1.1”項(xiàng)下操作，測(cè)定樣品溶液的吸光度并計(jì)算蛋白含量。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為0.36 mg/mL的對(duì)照品溶液1.0 mL，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算樣品中蛋白的含量，平行測(cè)定6次。結(jié)果，蛋白含量的RSD為1.87%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取蟬蛻脫脂粉末6份，每份2 g，根據(jù)得到的最優(yōu)工藝條件按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算樣品中蛋白的含量。結(jié)果，樣品中蛋白含量的RSD為1.45%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取蟬蛻脫脂粉末2 g，根據(jù)得到的最優(yōu)工藝條件按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，依法加入堿性銅和福林酚試液后搖勻，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定分別放置30、40、45、50、55、60 min時(shí)樣品的吸光度，并計(jì)算樣品中蛋白的含量。結(jié)果，樣品中蛋白含量的RSD為1.65%（n=6），表明該法在顯色后60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密稱(chēng)取6份已測(cè)定蛋白含量的蟬蛻脫脂粉末（含蛋白130.10 mg），加入等量的牛血清白蛋白，稀釋至適宜濃度，根據(jù)得到的最優(yōu)工藝條件按“2.1.1”項(xiàng)下方法操作并測(cè)定樣品的吸光度，并計(jì)算樣品中蛋白的含量。結(jié)果，蟬蛻蛋白的平均加樣回收率為99.4%，RSD為2.35%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化蟬蛻蛋白的提取工藝

蟬蛻蛋白的提取量受多種因素的影響，蛋白含有可解離的氨基和羧基，pH會(huì)影響解離基團(tuán)的解離、改變蛋白所帶電荷，從而影響蛋白的溶解性[13]。查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)是影響蛋白提取率的關(guān)鍵因素[14-17]。故本研究選樣品溶液pH、液料比、超聲時(shí)間、提取次數(shù)為因素，考察其對(duì)蟬蛻蛋白提取量的影響。

2.2.1 樣品溶液pH對(duì)蟬蛻蛋白提取量的影響 精密稱(chēng)取蟬蛻脫脂粉末2 g，置于錐形瓶中，加入15倍量75%乙醇，用氫氧化鈉分別調(diào)樣品溶液pH至7、8、9、10、11，室溫超聲提取2次，每次60 min。提取液濾過(guò)，合并濾液，加水定容至250 mL，按照“2.1.1”項(xiàng)下操作，測(cè)定樣品吸光度并計(jì)算其中蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)圖1A。

由圖1A可知，蟬蛻蛋白提取量隨樣品溶液pH的增大而增大，當(dāng)樣品溶液pH小于10時(shí)，隨著溶液pH的增大蟬蛻蛋白提取量變化較快，當(dāng)樣品溶液pH大于10時(shí)，變化趨于平緩，考慮到強(qiáng)堿可能會(huì)導(dǎo)致蟬蛻蛋白結(jié)構(gòu)破壞，從而引起蛋白變性失活，因此本研究將蟬蛻蛋白提取液的pH固定為10。

2.2.2 液料比對(duì)蟬蛻蛋白提取量的影響 精密稱(chēng)取蟬蛻脫脂粉末2 g，置于錐形瓶中，分別按10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1（V/m，mL/g）的液料比加入相應(yīng)量的75%乙醇，用氫氧化鈉調(diào)溶液pH至10，室溫超聲提取60 min，提取2次，濾過(guò)，合并2次提取液；將提取液加水定容至250 mL，按照“2.1.1”項(xiàng)下操作測(cè)定樣品溶液吸光度并計(jì)算其中蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)圖1B。

由圖1B可知，蟬蛻蛋白的提取量隨著液料比的增加而增大，當(dāng)液料比達(dá)到25 ∶ 1時(shí)，提取量達(dá)到最大，此后繼續(xù)增加液料比，蛋白提取量變化比較緩慢。故選擇液料比25 ∶ 1作為響應(yīng)面分析液料比因素的中心點(diǎn)。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)蟬蛻蛋白提取量的影響 精密稱(chēng)取蟬蛻脫脂粉末2 g，置于錐形瓶中，加入25倍量的75%乙醇，用氫氧化鈉調(diào)溶液pH至10，分別于室溫條件下超聲提取30、45、60、75、90 min，提取2次，濾過(guò)，合并濾液，加水定容至250 mL，按照“2.1.1”項(xiàng)下操作測(cè)定樣品溶液吸光度并計(jì)算其中蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)圖1C。

由圖1C可知，超聲時(shí)間少于60 min時(shí)，蟬蛻蛋白提取量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；超聲時(shí)間為60 min時(shí)，蛋白提取量最大，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，蛋白提取量有降低的趨勢(shì)，這可能是由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，蛋白發(fā)生降解造成的。故選擇超聲時(shí)間60 min作為響應(yīng)面分析超聲時(shí)間因素的中心點(diǎn)。

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)蟬蛻蛋白提取量的影響 精密稱(chēng)取蟬蛻脫脂粉末2 g，置于錐形瓶中，加入25倍量75%乙醇，用氫氧化鈉調(diào)溶液pH至10，室溫超聲提取60 min，分別提取1、2、3、4、5次，提取液濾過(guò)，合并濾液，加水定容至250 mL。按照“2.1.1”項(xiàng)下操作測(cè)定樣品溶液吸光度并計(jì)算其中蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)圖1D。

由圖1D可知，提取1次時(shí)蟬蛻蛋白不能被很好地提取出來(lái)，提取次數(shù)超過(guò)2次時(shí)，隨著提取次數(shù)的增加，蛋白提取量略有提高，但變化較緩慢。故選擇提取次數(shù)為2次作為響應(yīng)面分析提取次數(shù)因素的中心點(diǎn)。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化蟬蛻蛋白的提取工藝

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，最終選擇液料比（X1）、超聲時(shí)間（X2）、提取次數(shù)（X3）為因素，以蟬蛻蛋白提取量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以?xún)?yōu)化蟬蛻蛋白的提取工藝，總共設(shè)計(jì)了17組試驗(yàn)點(diǎn)，因素與水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到超聲輔助提取蟬蛻蛋白的二次回歸方程為Y=64.90+5.00X1+6.38X2+9.23X3+1.26X1X2+3.26X1X3+1.04X2X3-5.92X12-10.46X22-14.74X32，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，本研究所選模型的P<0.000 1，表明該模型具有顯著性；同時(shí)，失擬項(xiàng)的P=0.114 9>0.05，不具有顯著性，表明模型無(wú)誤，模型擬合度較好；R2=0.994 8，Radj2=0.972 3說(shuō)明該模型可以解釋97.23%的數(shù)據(jù)。綜上所述，該模型具有較好的準(zhǔn)確性和可靠性，可用于超聲輔助提取蟬蛻蛋白量的預(yù)測(cè)和分析。方差分析結(jié)果表明，液料比、超聲時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)蟬蛻蛋白提取量均具有顯著影響，影響大小為提取次數(shù)>提取時(shí)間>液料比，且液料比、提取次數(shù)和液料比、超聲時(shí)間的交互作用及二次項(xiàng)對(duì)蟬蛻蛋白提取量均具有顯著影響。

2.4 響應(yīng)面分析

將一個(gè)因素固定在零水平，通過(guò)對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，考察另兩個(gè)交互因素對(duì)蟬蛻蛋白提取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，液料比和超聲時(shí)間對(duì)蟬蛻蛋白提取量有影響，固定液料比不變，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)蟬蛻蛋白提取量先增加后降低；固定超聲時(shí)間不變，蟬蛻蛋白提取量隨液料比的增加而提高，且超聲時(shí)間對(duì)蟬蛻蛋白提取量的影響較大。液料比和提取次數(shù)交互作用的等高線圖較橢圓，表明其對(duì)蟬蛻蛋白提取量具顯著影響，曲線的左側(cè)較右側(cè)陡峭，表明提取次數(shù)影響較大。超聲時(shí)間與提取次數(shù)的交互作用等高線圖較圓，說(shuō)明其影響不顯著。得到蟬蛻蛋白的最優(yōu)提取工藝為液料比27.84 ∶ 1（mL/g）、提取時(shí)間65.38 min、提取次數(shù)2.39次，此時(shí)蟬蛻蛋白提取量為69.25 mg/g。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮到實(shí)際的可操作性，將上述得到的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行了修正，最終確定蟬蛻蛋白的提取條件為：取樣量2 g，液料比（28 ∶ 1，V/m，mL/g），超聲時(shí)間65 min，提取2次。以修正后的條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次，最終得到的蟬蛻蛋白提取量為65.45 mg/g（RSD=1.68%，n=3），與預(yù)測(cè)值（69.25 mg/g）的相對(duì)誤差為5.48%，表明該模型準(zhǔn)確可靠[18-19]。

2.6 蟬蛻蛋白的體外抗氧化活性研究

將最優(yōu)條件下提取獲得的提取液用鹽酸調(diào)pH至蟬蛻蛋白的等電點(diǎn)（pH=5.8），然后以離心半徑為9.5 cm、5 000 r/min離心10 min，純凈水洗滌沉淀2次，合并洗液，調(diào)溶液pH至中性，置于透析袋中，4 ℃透析48 h，冷凍干燥，純凈水復(fù)溶至所需質(zhì)量濃度，對(duì)其進(jìn)行體外抗氧化活性研究。

2.6.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[20]方法，分別取2 mL不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的蟬蛻蛋白溶液和VC溶液于具塞刻度試管中，再分別加入2 mL DPPH溶液（用無(wú)水乙醇稀釋制備成0.2 mmol/L），混合均勻，避光條件下室溫反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值，并計(jì)算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=[1-（As-A0）/Ac]×100%，其中，As為樣品與DPPH混合液的吸光度，A0為樣品與無(wú)水乙醇混合液的吸光度，Ac為純凈水與DPPH混合液的吸光度，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，蟬蛻蛋白對(duì)DPPH自由基具有一定的清除活性，但與活性較強(qiáng)的VC相比，其對(duì)DPPH自由基清除能力較弱。在質(zhì)量濃度為0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，蟬蛻蛋白對(duì)DPPH自由基清除率隨著蛋白濃度升高而增強(qiáng)，其半數(shù)清除濃度（IC50）為0.96 mg/mL。

2.6.2 ABTS自由基清除能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法[21]，制備7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液，將兩溶液等體積混合，室溫、避光條件下反應(yīng)過(guò)夜，作為母液。吸取1 mL的母液，用45 mL的甲醇稀釋至在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.7±0.005，即為ABTS的工作液。分別取2 mL的蟬蛻蛋白溶液和VC溶液（質(zhì)量濃度均分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）于具塞刻度試管中，再加入4 mL的ABTS工作液，避光反應(yīng)6 min，734 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值，并計(jì)算其對(duì)ABTS自由基的清除率：ABTS自由基清除率（%）=[1-（As-A0）/Ac]×100%，其中，As為樣品與ABTS混合液的吸光度，A0為樣品與甲醇混合液的吸光度，Ac為純凈水與ABTS混合液的吸光度，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，蟬蛻蛋白與VC對(duì)ABTS自由基均具有較強(qiáng)的清除活性。在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，蟬蛻蛋白對(duì)ABTS+自由基清除率即達(dá)97.0%，其作用與VC相當(dāng)。

3 討論

筆者在前期試驗(yàn)中考察了提取溶劑和提取方法對(duì)蟬蛻蛋白提取量的影響，分別以水和不同濃度的乙醇作為提取溶劑，結(jié)果以75%乙醇作為提取溶劑時(shí)蛋白提取量較高，且超聲輔助提取較浸提法提取得率高、提取時(shí)間短，故本研究以75%乙醇作為提取溶劑，采用超聲輔助提取法提取蟬蛻蛋白。在超聲提取過(guò)程中，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲溫度會(huì)逐漸升高，易使蛋白受熱變性[22]，為控制超聲溫度，筆者每隔15 min更換1次超聲提取器里的水以使其保持常溫，從而減少對(duì)提取蛋白的破壞。試驗(yàn)過(guò)程中，用鹽酸調(diào)節(jié)蟬蛻蛋白提取液的pH值使蛋白沉淀，通過(guò)稱(chēng)量沉淀物的質(zhì)量確定蟬蛻蛋白的等電點(diǎn)（質(zhì)量最大時(shí)對(duì)應(yīng)的pH值）為5.8。通過(guò)研究福林酚法、考馬斯亮藍(lán)法和二哇啉甲酸法測(cè)定蟬蛻蛋白含量的差異，發(fā)現(xiàn)福林酚法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，且有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)于多肽含量較高的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，選擇福林酚法測(cè)定較準(zhǔn)確[23]，故本研究選擇福林酚法測(cè)定蟬蛻蛋白的含量。

本研究選擇液料比、超聲時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選出蟬蛻蛋白的提取工藝，通過(guò)方差分析和驗(yàn)證試驗(yàn)表明，此模型準(zhǔn)確可靠。液料比、超聲時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)蟬蛻蛋白提取量有顯著性影響，且影響大小為提取次數(shù)>超聲時(shí)間>液料比。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)選，結(jié)合實(shí)際情況確定了最優(yōu)提取條件：液料比為28 ∶ 1，超聲時(shí)間65 min，提取2次，此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果蟬蛻蛋白提取量為65.45 mg/g，與二次方程預(yù)測(cè)值接近。

動(dòng)物藥為“血肉有情之品”，其因療效顯著、安全性高獲得廣大學(xué)者的關(guān)注，本結(jié)果表明，最優(yōu)條件下提取的蟬蛻蛋白具有較好的抗氧化活性，這可為天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。然而，本研究?jī)H進(jìn)行了體外抗氧化活性研究，故將在后續(xù)研究中需對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)抗氧化活性研究。

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（收稿日期：2017-10-24 修回日期：2018-01-17）

（編輯：林 靜）