謝朝云 熊蕓 覃家露 孫靜 楊懷 楊忠玲 熊永發(fā)

中圖分類(lèi)號(hào) R978.1；R969.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）08-1069-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.14

摘 要 目的：為臨床合理用藥、醫(yī)院感染控制提供參考。方法：收集2011年1月-2017年10月某院非痰標(biāo)本中分離出的產(chǎn)頭孢菌素酶（AmpC酶）陰溝腸桿菌，采用最低抑菌濃度法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用三維試驗(yàn)法確證產(chǎn)AmpC酶情況，采用雙紙片協(xié)同擴(kuò)散法檢測(cè)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）情況。結(jié)果：該院非痰標(biāo)本中共分離出產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌546株，占非痰標(biāo)本病原菌總數(shù)的4.80%（546/11 375），占陰溝腸桿菌總數(shù)的38.97%（546/1 401）；檢出率排序前3位的非痰標(biāo)本依次為傷口分泌物（27.29%）、中段尿（25.82%）、血液（21.79%），檢出率較高的科室依次為重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）（22.89%）、神經(jīng)外科（18.68%）和普外科（16.67%）。產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌對(duì)大部分常用抗菌藥物的耐藥率>40%，其中不同年度該菌對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、慶大霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、妥布霉素、米諾環(huán)素的耐藥率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率<2%。546株產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌中，共檢出產(chǎn)ESBLs菌株68株，其2011-2017年的檢出率依次為5.77%、6.06%、8.70%、10.26%、13.79%、17.35%、18.75%。結(jié)論：該院產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌主要來(lái)自于傷口分泌物、中段尿等標(biāo)本，且集中于ICU、神經(jīng)外科等科室。該菌耐藥情況嚴(yán)峻，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)等抗菌藥物的耐藥率上升明顯；產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率逐年上升；但對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物敏感，可將其作為經(jīng)驗(yàn)首選藥物。臨床應(yīng)加強(qiáng)產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌耐藥及產(chǎn)酶情況的監(jiān)測(cè)，并結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選用抗菌藥物，以阻止或延緩其耐藥率的快速上升。

關(guān)鍵詞 非痰標(biāo)本；陰溝腸桿菌；頭孢菌素酶；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；臨床分布；耐藥性

ABSTRACT OBJECTIVE： To provide reference for rational drug use and hospital infection control. METHODS： AmpC enzyme-producing Enterobacter cloacae were isolated from non-sputum specimen of a hospital during Jan. 2011-Oct. 2017. Drug sensitivity test was conducted by using MIC. The situation of AmpC enzyme production was confirmed by three dimensional test， and that of ESBLs-producing stain was detected with double-disk synergy test. RESULTS： There were 546 strains of AmpC enzyme-producing E. cloacae isolated from non-sputum specimen of the hospital， accounting for 4.80% of non-sputum specimen （546/11 375） and 38.97% of E. cloacae （546/1 401）. Top 3 non-sputum samples in the list of detection rate were wound secretion （27.29%）， midstream urine （25.82%） and blood （21.79%）， and the departments with high detection rate were ICU （22.89%）， neurosurgery department （18.68%） and general surgery department （16.67%）. Resistance rate of AmpC enzyme-producing E. cloacae to most commonly used antibiotics was higher than 40%. There was statistical significance in resistant rate of the bacteria to ceftriaxone， cefotaxime， gentamicin， nitrofurantoin， levofloxacin， piperacillin/tazobactam， cefoperazone， ceftazidime， cefepime， tobramycin and minocycline among different years （P<0.05）. The resistant rate to imipenem and meropenem was lower than 2%. Among 546 strains of AmpC enzyme- producing E. cloacae， 68 strains of ESBLs were detected， and detection rates were 5.77%， 6.06%， 8.70%， 10.26%， 13.79%， 17.35%， 18.75% during 2011-2017. CONCLUSIONS： AmpC enzyme-producing E. cloacae are mainly isolated from samples as wound secretion and midstream urine， and mainly come from ICU and neurosurgery department. The drug resistance of the bacteria is severe， and drug resistance of the bacteria to antibiotics as β-lactams and quinolones is increased significantly. The detection rate of ESBLs-producing strain increases year by year. The bacteria are sensitive to carbapenems antibiotics， which can be regarded as first choice. It is necessary to strengthen drug resistance and enzyme production monitoring of AmpC enzyme-producing E. cloacae， select antibiotics combined with results of drug sensitivity test so as to prevent or delay the rapid increase of its resistance rate.

KEYWORDS Non-sputum specimen； Enterobacter cloacae； AmpC enzyme； ESBLs； Clinical distribution； Drug resistance

頭孢菌素酶即AmpC酶（AmpC enzyme）是介導(dǎo)陰溝腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥的最重要的酶，主要由染色質(zhì)或質(zhì)粒介導(dǎo)編碼產(chǎn)生[1]。由于抗菌藥物的不合理使用，產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌越來(lái)越多，已成為臨床治療的難題[1]。統(tǒng)計(jì)分析產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌的臨床分布與耐藥趨勢(shì)，可為臨床合理選用抗菌藥物提供參考；但既往研究大多未剔除痰標(biāo)本或以痰標(biāo)本為主，易受到環(huán)境污染與定植菌的干擾，使結(jié)果備受質(zhì)疑[2]。因此，本研究對(duì)貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院2011年1月-2017年10月臨床非痰標(biāo)本（傷口分泌物、清潔中段尿、血液、胸腔積液、腹水、穿刺液、腦脊液等）分離出的產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌的臨床分布進(jìn)行分析，對(duì)菌株耐藥性及其變化情況進(jìn)行探討，以期為臨床合理用藥、醫(yī)院感染控制提供參考。

1 材料

PhoenixTM 100型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)及配套試劑（美國(guó)BD公司）；NS-100B型臺(tái)式空氣浴恒溫?fù)u床（上海皓莊儀器有限公司）；Avanti J-E型多用途高效離心機(jī)[貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司]；頭孢西丁、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢他啶等藥敏紙片以及M-H平板、肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；質(zhì)控菌株產(chǎn)酶型大腸埃希菌（ATCC 35218）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、大腸埃希菌（ATCC 25922）由原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。

2 資料與方法

2.1 菌株來(lái)源

來(lái)源于該院2011年1月-2017年10月臨床送檢的非痰標(biāo)本中分離出的產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌，剔除同一患者檢出的重復(fù)菌株。

2.2 菌株分離、培養(yǎng)、鑒定及藥敏試驗(yàn)

所有菌株均按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）[3]進(jìn)行分離、培養(yǎng)，采用PhoenixTM 100型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，采用上述儀器和最低抑菌濃度法（Minimum inhibitory concentration，MIC）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判定參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）各年的標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 產(chǎn)AmpC酶菌株的確證

產(chǎn)AmpC酶菌株的確證采用三維試驗(yàn)法[4]。取待測(cè)菌株菌落1～2個(gè)，接種于肉湯培養(yǎng)基中，置于35 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6 h后，以離心半徑16 cm、轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心30 min，取沉淀凍融（-20 ℃～室溫）5次，加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）混勻，于4 ℃下以離心半徑16 cm、轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心60 min，上清液即為待測(cè)菌株β-內(nèi)酰胺酶粗提液，將上述粗提液置于-20 ℃冰箱中保存，備用。另將0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏馁|(zhì)控菌株[大腸埃希菌（ATCC 25922）]菌懸液均勻涂布在M-H平板中，將一張頭孢西丁藥敏紙片貼于平板中央，于紙片邊緣5 mm處鉆一小孔，加入待測(cè)菌株β-內(nèi)酰胺酶粗提液50 μL，于35 ℃下培養(yǎng)16～18 h。若小孔與抑菌圈交接處長(zhǎng)菌區(qū)域擴(kuò)大，則判定待測(cè)菌株產(chǎn)AmpC酶。

2.4 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended spectrum beta- lactamase，ESBLs）菌株的檢測(cè)

產(chǎn)ESBLs菌株的檢測(cè)采用雙紙片協(xié)同擴(kuò)散法，結(jié)果判定參照CLSI推薦標(biāo)準(zhǔn)[5]。將待測(cè)菌株接種于M-H平板上，分別將頭孢他啶（30 μg）、頭孢他啶/克拉維酸（30 μg/10 μg）、頭孢噻肟（30 μg）、頭孢噻肟/克拉維酸（30 μg/10 μg）藥敏紙片貼于平板上，于35 ℃下培養(yǎng)16～18 h。若頭孢噻肟抑菌圈直徑≤27 mm，頭孢他啶抑菌圈直徑≤22 mm，則初篩為ESBLs陽(yáng)性；若頭孢他啶/克拉維酸或頭孢噻肟/克拉維酸抑菌圈直徑比頭孢他啶或頭孢噻肟的抑菌圈直徑增大≥5 mm，則判定待測(cè)菌株產(chǎn)ESBLs。

2.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用WHONET 5.6軟件對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以株數(shù)或率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌分布情況

該院非痰標(biāo)本中共分離出病原菌11 375株，包括腸桿菌科細(xì)菌4 588株、陰溝腸桿菌1 401株，其中產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌546株（2011-2017年依次為52、66、69、78、87、98、96株），占非痰標(biāo)本病原菌總數(shù)的4.80%，占腸桿菌科細(xì)菌總數(shù)的11.90%，占陰溝腸桿菌總數(shù)的38.97%。546株產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌主要來(lái)自于傷口分泌物、中段尿與血液標(biāo)本，分別占27.29%、25.82%、21.79%，詳見(jiàn)表1。

3.2 產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌的科室分布

該院非痰標(biāo)本中分離出的546株產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌主要來(lái)自于重癥監(jiān)護(hù)病房（Intensive care unit，ICU）、神經(jīng)外科和普外科，分別占22.89%、18.68%、16.67%，詳見(jiàn)表2。

3.3 產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌的耐藥情況

該院非痰標(biāo)本分離出的產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌對(duì)常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)大部分常用抗菌藥物的耐藥率較高（耐藥率>40%），且總體呈上升趨勢(shì)；其中，不同年度該菌對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、慶大霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、妥布霉素、米諾環(huán)素的耐藥率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；該菌對(duì)亞胺培南、美羅培南敏感（耐藥率<2%），詳見(jiàn)表3。

3.4 產(chǎn)ESBLs菌株的檢出情況

546株產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌中，共檢出產(chǎn)ESBLs菌株68株，2011-2017年依次檢出3、4、6、8、12、17、18株，檢出率依次為5.77%、6.06%、8.70%、10.26%、13.79%、17.35%、18.75%，呈逐年上升的趨勢(shì)。

4 討論

痰是下呼吸道分泌物，由于解剖部位特殊，咳出痰液經(jīng)過(guò)咽部和口腔時(shí)，會(huì)不可避免地混入上呼吸道中的正常或定植菌群，直接影響病原學(xué)檢查結(jié)果，導(dǎo)致其結(jié)果備受質(zhì)疑[2]。鑒于此，本研究以該院臨床送檢的非痰標(biāo)本作為研究對(duì)象，對(duì)其檢出的產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌的臨床分布和耐藥情況進(jìn)行分析，以期更為真實(shí)地反映產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌的病原學(xué)特征。

本研究結(jié)果顯示，該院非痰標(biāo)本檢出的產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌占陰溝腸桿菌總數(shù)的38.97%，低于楊洪芬等[6]報(bào)道的47.1%，可能與不同地區(qū)陰溝腸桿菌的耐藥情況有所差異有關(guān)[7]。該院產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌的檢出率在傷口分泌物、中段尿和血液等標(biāo)本中較高，分別為27.29%、25.82%和21.79%，與莫基浩等[8]的報(bào)道結(jié)果接近，提示該院產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌所致呼吸道外感染以傷口、泌尿道與血流感染較為常見(jiàn)。

該院非痰標(biāo)本中檢出的產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌多來(lái)自于ICU（22.89%）、神經(jīng)外科（18.68%）和普外科（16.67%）。上述科室收治的患者免疫功能低下、基礎(chǔ)疾病多、病情復(fù)雜，且大多病情重、住院時(shí)間長(zhǎng)，需接受手術(shù)、機(jī)械通氣、動(dòng)靜脈插管等創(chuàng)傷性診療，同時(shí)伴意識(shí)障礙及長(zhǎng)期使用廣譜抗菌藥物等情況，易導(dǎo)致產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的定植與感染，臨床應(yīng)予以密切關(guān)注[9]。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，非痰標(biāo)本中檢出的產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌對(duì)頭孢曲松、哌拉西林、頭孢哌酮的耐藥率已超過(guò)50%，對(duì)大部分常用抗菌藥物的耐藥率已超過(guò)40%，提示該院產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況嚴(yán)峻，不建議臨床將其作為治療該菌感染的首選藥物。該菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥主要與菌株產(chǎn)生AmpC酶有關(guān)[10]。AmpC酶不僅可由染色質(zhì)介導(dǎo)，也可由質(zhì)粒介導(dǎo)編碼產(chǎn)生，還可通過(guò)接合子、整合子移位，質(zhì)粒復(fù)制及轉(zhuǎn)化等方式在同種屬或不同種屬革蘭氏陰性菌間傳播，引起暴發(fā)流行，是介導(dǎo)陰溝腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥的主要原因[1，11]。本研究顯示，該酶可與抗菌藥物β-內(nèi)酰胺環(huán)羰基部分共價(jià)結(jié)合，使β-內(nèi)酰胺環(huán)開(kāi)環(huán)，導(dǎo)致菌株對(duì)頭孢菌素類(lèi)等抗菌藥物高水平耐藥，且不被克拉維酸等β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制[12]。同時(shí)，產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌易產(chǎn)生ESBLs[13]，ESBLs同樣可水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)尤其是第三代頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物耐藥[14]；此外，產(chǎn)酶基因可通過(guò)垂直傳播、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子等傳播方式傳遞給非產(chǎn)ESBLs菌株，導(dǎo)致其對(duì)青霉素類(lèi)、第一～三代頭孢菌素類(lèi)和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥[15]。本研究顯示，該菌僅對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率較低（耐藥率<2%），與Doi Y等[16]的報(bào)道相近，提示碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物可作為臨床治療產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌感染的經(jīng)驗(yàn)首選藥物。

本研究結(jié)果顯示，該院546株產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌中，產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率從2011年的5.77%上升至2017年的18.75%，呈逐年上升的趨勢(shì)；同時(shí)，近7年來(lái)該菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率總體呈上升趨勢(shì)，且其各年對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、慶大霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、妥布霉素、米諾環(huán)素的耐藥率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示該菌的耐藥率變化明顯，且主要表現(xiàn)為對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、第四代頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物的耐藥率上升明顯，筆者認(rèn)為可能與產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌常同時(shí)攜帶氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因、喹諾酮類(lèi)耐藥基因和磺胺類(lèi)耐藥基因，產(chǎn)生氨基糖苷類(lèi)鈍化酶，主動(dòng)外排系統(tǒng)的活躍，細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的變異，細(xì)胞壁屏障的改變，耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移和克隆傳播等因素有關(guān)[17-18]。值得注意的是，該院產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌對(duì)第四代頭孢菌素類(lèi)藥物頭孢吡肟的耐藥率明顯升高（由21.15%上升至40.63%），與余建洪等[19]的研究結(jié)果不同，可能與臨床不合理使用抗菌藥物尤其是第四代頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物有關(guān)[20]。耐藥率的明顯升高是一個(gè)危險(xiǎn)信號(hào)，臨床應(yīng)予以高度重視，加強(qiáng)消毒隔離，嚴(yán)格執(zhí)行抗菌藥物分級(jí)管理制度，提高臨床標(biāo)本送檢率，在細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定及藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)下合理選用抗菌藥物，保證臨床抗感染治療的安全、有效[20]。

綜上所述，該院產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌主要來(lái)自于傷口分泌物、中段尿和血液等非痰標(biāo)本，主要集中于ICU、神經(jīng)外科和普外科，易引起傷口、泌尿道、血液等呼吸道外感染。該菌耐藥情況嚴(yán)峻，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)等抗菌藥物的耐藥率上升明顯；產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率逐年上升；但對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物較為敏感，可將其作為經(jīng)驗(yàn)首選藥物。臨床應(yīng)注意加強(qiáng)產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌耐藥及產(chǎn)酶情況的監(jiān)測(cè)，及時(shí)掌握其耐藥率的變化趨勢(shì)，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選用抗菌藥物，以阻止或延緩其耐藥率的快速上升。本研究雖初步反映了產(chǎn)AmpC酶的臨床分布及耐藥性變化情況，但其耐藥機(jī)制、耐藥基因、產(chǎn)酶量等方面仍有待后續(xù)深入研究。

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（收稿日期：2017-11-03 修回日期：2017-12-30）

（編輯：張?jiān)拢?/p>