黃旭華 湯慶坤 羅梅蘭 黃深惠 蔣師東 夏青 黃景灘 李安華 魯成 陳小青 毛洪斌 潘志新

摘要：【目的】全面掌握廣西昆蟲微孢子蟲資源及其分布情況，并進行感染性和分類研究，為經(jīng)濟昆蟲微孢子蟲病的防控提供參考依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^人工捕捉或誘蟲燈引誘方式在廣西蠶區(qū)的桑園、菜地及周圍收集野外昆蟲，顯微鏡檢驗各種野外昆蟲微孢子蟲的自然感染率；通過生物試驗鑒定部分野外昆蟲微孢子蟲對家蠶的食下感染性，并分別檢測桑尺蠖微孢子蟲和菜粉蝶微孢子蟲對原始寄主的胚種傳染性；基于SSU rRNA序列構(gòu)建昆蟲微孢子蟲系統(tǒng)發(fā)育進化樹，明確昆蟲微孢子蟲的分類特征。【結(jié)果】廣西昆蟲微孢子蟲資源分布廣泛，大部分昆蟲已感染微孢子蟲，其中菜粉蝶、稻縱卷葉螟、桑螟、桑尺蠖、斜紋夜蛾和紅腹燈蛾的微孢子蟲自然感染率分別為54.95%、4.38%、0.08%、0.28%、0.64%和1.14%，其他鱗翅目昆蟲的總體微孢子蟲感染率為0.75%。部分昆蟲微孢子蟲可食下感染家蠶，交叉感染率達40.00%；部分昆蟲微孢子蟲還具有很強的胚種傳染力，其中桑尺蠖微孢子蟲和菜粉蝶微孢子蟲對原始寄主的胚種傳染率分別為77.48%和66.15%。從桑尺蠖分離獲得的3株微孢子蟲雖然為不同的微孢子蟲，但均屬于Nosema屬，與家蠶微孢子蟲同屬異種。【結(jié)論】在廣西各地區(qū)存在豐富的昆蟲微孢子蟲資源，種類多樣，且大部分昆蟲微孢子蟲屬于Nosema屬，與家蠶微孢子蟲親緣關(guān)系密切；部分野外昆蟲微孢子蟲還對家蠶形成交叉?zhèn)魅疚：Φ娘L(fēng)險，因此杜絕昆蟲微孢子蟲污染桑葉交叉感染家蠶是控制家蠶微粒子病發(fā)生的重要措施。

關(guān)鍵詞： 昆蟲微孢子蟲；資源分布；感染性；分類特征

中圖分類號： S884.21 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）08-1541-07

0 引言

【研究意義】昆蟲是自然界中種類、數(shù)量最多的生物，約占地球上所有生物物種的50%以上（張茂林和王戎疆，2011），而微孢子蟲（Microsporidian）是一種嗜昆蟲的病原微生物，幾乎整個昆蟲綱的昆蟲均能被微孢子蟲寄生，尤其以鱗翅目和雙翅目昆蟲最常見，且大多數(shù)昆蟲種類中至少可寄生一種以上微孢子蟲（劉吉平和曾玲，2006）。微孢子蟲病一方面影響野外昆蟲種群的自然平衡，另一方面對家蠶、柞蠶等經(jīng)濟和資源昆蟲造成嚴重危害（梁喜麗等，2018）。因此，開展野外昆蟲微孢子蟲資源調(diào)查，對控制經(jīng)濟昆蟲微粒子病發(fā)生和了解自然界昆蟲害蟲種群自我調(diào)節(jié)規(guī)律具有重要意義，也有利于篩選出優(yōu)質(zhì)昆蟲微孢子蟲作為農(nóng)業(yè)生物防治素材以促進生物防治新方法的推廣應(yīng)用。【前人研究進展】昆蟲微孢子蟲是一類重要的病原微生物，至今發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲已超過200屬1300～1500種，可侵染雙翅目和鱗翅目昆蟲的在400種以上（梁喜麗等，2018）。長期以來，為了充分了解野外昆蟲微孢子蟲對家蠶的交叉?zhèn)魅拘裕?967～1979年日本學(xué)者廣瀨安春等曾在日本蠶區(qū)桑園收集102種昆蟲（約25000頭），經(jīng)檢驗發(fā)現(xiàn)65種昆蟲存在微孢子蟲感染，其中從12種昆蟲體內(nèi)分離獲得的微孢子蟲對家蠶具有感染力（周澤揚等，2014）；國內(nèi)學(xué)者鄭祥明等（2003）也于1995～1998年在廣東蠶區(qū)桑園、菜地及蠶房附近收集野外昆蟲共389種（約20000頭），檢驗發(fā)現(xiàn)在51種昆蟲中存在54種微孢子蟲，其中18種可經(jīng)口感染家蠶；黃旭華等（2010）于2007～2009年在廣西蠶區(qū)收集野外昆蟲約9000頭，初步查找出一些能感染微孢子蟲的野外昆蟲種類。此外，為充分了解微孢子蟲對昆蟲的危害性，已有學(xué)者對某些種類昆蟲進行微孢子蟲感染率調(diào)查。王容燕等（2008）于1998～2003年在河北省調(diào)查棉鈴蟲微孢子蟲病的發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)田間棉鈴蟲微孢子蟲病呈流行趨勢，第4代幼蟲微孢子蟲感染率達49.0%，且微孢子蟲對棉鈴蟲致病力極強；Fürst等（2014）在英格蘭馬恩島設(shè)點調(diào)查家養(yǎng)蜜蜂與野外熊蜂的微孢子蟲和病毒發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)存在家養(yǎng)蜜蜂傳染微孢子蟲和變形翼病毒給野生熊蜂的風(fēng)險，進而危害作物授粉蜂群密度，造成全球作物授粉效率降低，最終影響全球食物產(chǎn)量。【本研究切入點】近年利用昆蟲微孢子蟲作為生物農(nóng)藥防治農(nóng)業(yè)和林業(yè)害蟲已成為研究熱點。據(jù)報道，在我國新疆、內(nèi)蒙古、青海、甘肅等地使用過蝗蟲微孢子蟲的草場，近十年均未再度暴發(fā)大面積的蝗災(zāi)（石旺鵬和季榮，2017）。廣西地處亞熱帶地區(qū)，氣候高溫多濕，有利于植物生長的同時有利于眾多昆蟲種類繁殖，且廣西是我國蠶業(yè)生產(chǎn)規(guī)模第一大?。▍^(qū)），桑樹種植面積逐年擴大，害蟲繁多，但目前尚無針對廣西昆蟲微孢子蟲資源的系統(tǒng)報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】在廣西蠶區(qū)的桑園、菜地及其周圍收集野外昆蟲進行檢驗，旨在全面掌握廣西昆蟲微孢子蟲資源及其分布情況，并進行感染性和分類研究，為經(jīng)濟昆蟲微孢子蟲病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試家蠶品種為932×芙蓉。野外昆蟲分別收集于廣西南寧市石埠鎮(zhèn)、武鳴區(qū)和廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站、柳州市柳江縣、河池市宜州區(qū)和南丹縣、百色市德保縣、貴港市港北區(qū)及崇左市扶綏縣。

1. 2 昆蟲微孢子蟲自然感染率調(diào)查

2014～2017年在各調(diào)查點的桑園及其周圍通過人工捕捉或誘蟲燈引誘方式捕捉各種野外昆蟲，對收集的昆蟲進行分類鑒定后逐只研磨鏡檢或集團研磨鏡檢，判定是否感染微孢子蟲，然后統(tǒng)計各種野外昆蟲微孢子蟲的自然感染率。

1. 3 昆蟲微孢子蟲感染力調(diào)查

1. 3. 1 部分昆蟲微孢子蟲對家蠶的病原性 收集部分昆蟲微孢子蟲，參照黃少康和魯興萌（2004）的方法進行分離純化。將各純化昆蟲微孢子蟲配制成1.0×106個/mL的孢子懸液，再分別取各種孢子懸液0.2 mL，涂抹于2張面積8 cm2的桑葉上，飼喂30頭2齡起蠶。待蠶兒吃盡帶毒桑葉后，以經(jīng)漂白粉精溶液（含0.5%有效氯）浸泡消毒10 min的潔凈桑葉飼養(yǎng)至5齡第2 d，對所有蠶兒逐頭研磨鏡檢，調(diào)查各昆蟲微孢子蟲對家蠶的感染情況（羅梅蘭等，2012）。

1. 3. 2 部分昆蟲微孢子蟲的胚種傳染率調(diào)查 將桑尺蠖微孢子蟲（Microsporidan isolated from Phtho-nandria atrilineata Butler，PaBM1）配制成1.0×106個/mL的孢子懸液，再將潔凈桑葉片浸泡于孢子懸液中，取出稍微晾干，飼喂桑尺蠖3齡幼蟲，連續(xù)攻毒12 h后改用經(jīng)漂白粉精溶液（含0.5%有效氯）浸泡消毒10 min的潔凈桑葉飼養(yǎng)至化蛹，經(jīng)化蛾、交配和產(chǎn)卵后，檢驗桑尺蠖成蟲是否有微粒子孢子，收集3個卵塊，分別孵化出桑尺蠖幼蟲；分區(qū)利用葉面消毒桑葉飼喂桑尺蠖幼蟲3 d，再逐只檢驗，調(diào)查桑尺蠖微孢子蟲對桑尺蠖的胚種傳染率。同時，在菜地調(diào)查菜粉蝶幼蟲（菜青蟲）的危害情況，收集3窩未散開的菜青蟲，逐只研磨鏡檢攜帶微孢子蟲情況，調(diào)查菜粉蝶微孢子蟲的胚種傳染率。

1. 4 部分昆蟲微孢子蟲分子系統(tǒng)發(fā)育進化分析

1. 4. 1 基因組DNA提取 參照劉吉平等（2004）、羅梅蘭等（2012）的方法，采用CTAB法抽提微孢子蟲基因組DNA。

1. 4. 2 SSU rRNA序列PCR擴增及測序分析 參照Huang等（2014）的方法選取引物18f（5'-CACCAGGTTGATTCTGCC-3'）和1537r（5'-TTATGATCCTCCTAATGGTTC-3'），再依據(jù)黃旭華等（2012）的方法PCR擴增微孢子蟲SSU rRNA序列，回收目的條帶DNA后分別進行克隆。將各種微孢子蟲SSU rRNA序列的克隆產(chǎn)物送至上海立菲生物技術(shù)有限公司進行測序。

1. 4. 3 系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建 參照董世楠等（2009）的方法，將測序得到的微孢子蟲SSU rRNA序列與GenBank中的10種不同種屬微孢子蟲進行同源性比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹；同時對各種微孢子蟲SSU rRNA序列進行相似度和遺傳距離（分化度）分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 廣西昆蟲微孢子蟲資源分布情況

2014～2017年，先后從桂南（南寧市、崇左市）、桂中（柳州市）、桂東（貴港市）、桂西（百色市）和桂北（河池市）等蠶區(qū)的桑園、菜地及其周圍收集野外昆蟲，主要是鱗翅目昆蟲及少量鞘翅目昆蟲，其種類有桑園內(nèi)的桑螟、桑尺蠖、斜紋夜蛾、桑毛蟲、紅腹燈蛾、桑天牛和桑蘭葉甲及桑園周圍的菜粉蝶、稻縱卷葉螟和草螟等。4年期間共收集野外昆蟲5萬多頭，檢驗發(fā)現(xiàn)攜帶微孢子蟲孢子的昆蟲有368頭，總感染率為0.70%，其中2014、2015、2016和2017年分別收集昆蟲6361、5501、22933和17569頭，對應(yīng)的微孢子蟲自然感染率為1.13%、1.62%、0.34%和0.73%。大部分野外昆蟲種類均存在一定的微孢子蟲感染情況，且差異明顯（表1）。在所有收集的昆蟲中，以菜粉蝶微孢子蟲感染率最高，達54.95%，其次是稻縱卷葉螟（4.38%），桑園外其他鱗翅目昆蟲微孢子蟲感染率為0.75%；桑園內(nèi)主要昆蟲桑螟、桑尺蠖、斜紋夜蛾和紅腹燈蛾的微孢子蟲自然感染率分別為0.08%、0.28%、0.64%和1.14%，桑毛蟲、桑天牛、桑蘭葉甲和草螟等未檢出微孢子蟲，可能是收集調(diào)查的昆蟲數(shù)量較少。從區(qū)域分布來看，桂南、桂中、桂東、桂西和桂北的野外昆蟲微孢子蟲自然感染率分別為0.75%、0.50%、0.53%、0.38%和0.51%（表2），其中桂南地區(qū)的昆蟲微孢子蟲感染率較其他地區(qū)偏高，是由于該地區(qū)的菜粉蝶和稻縱卷葉螟微孢子蟲自然感染率較高所致?？梢姡瑥V西昆蟲微孢子蟲資源分布范圍廣，大部分昆蟲均已感染微孢子蟲，且呈現(xiàn)出桑園外昆蟲微孢子蟲自然感染率比桑園內(nèi)昆蟲高的現(xiàn)象。

2. 2 野外昆蟲微孢子蟲對家蠶的感染性

共測定65株昆蟲微孢子蟲對家蠶的食下感染性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有26株昆蟲微孢子蟲可食下感染家蠶（表3），對家蠶的交叉感染率達40.00%，進一步證實野外昆蟲微孢子蟲對家蠶具有交叉?zhèn)魅拘裕巴饫ハx是家蠶微粒子病發(fā)生的重要傳染源。

2. 3 野外昆蟲微孢子蟲的胚種傳染性

微孢子蟲胚種傳染是危害寄主的重要方式。由表4可看出，桑尺蠖微孢子蟲對桑尺蠖寄主的平均胚種傳染率達77.48%，說明具有很強的胚種傳染力。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，菜粉蝶微孢子蟲對菜青蟲（菜粉蝶）的平均胚種傳染率達66.15%（表4），說明也具有很強的胚種傳染力。

2. 4 桑尺蠖微孢子蟲SSU rRNA序列分析結(jié)果

經(jīng)PCR擴增和測序分析，獲得3株桑尺蠖微孢子蟲（PaBM3、PaBM5和PaBM6）的SSU rRNA序列，長度為1100～1300 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。將測序獲得的微孢子蟲SSU rRNA序列與GenBank中的10種不同種屬微孢子蟲進行同源性比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株桑尺蠖微孢子蟲間的相似度為98.9%～99.9%、分化度為0.1～0.3（圖1），與已知微孢子蟲間的相似度（37.3%～99.9%）和分化度（0.1～54.5）存在明顯差異，初步推測這3株桑尺蠖微孢子蟲為不同的微孢子蟲。基于微孢子蟲SSU rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，發(fā)現(xiàn)獲得的3株桑尺蠖微孢子蟲均位于Nosema屬類群中（圖2），即3株桑尺蠖微孢子蟲雖然為不同的微孢子蟲，但均屬于Nosema屬。

3 討論

微孢子蟲是一類專營細胞內(nèi)寄生的原生動物，能感染從原生生物到人類的幾乎所有動物（Winters and Faisai，2014），是許多昆蟲、魚類、兔類、皮毛動物、嚙齒類及靈長類動物的重要病原，是引發(fā)人畜腹瀉的主要病原（邱璐瑤等，2017；李東方等，2018），也是蝦、蟹等水產(chǎn)動物的致死病原微生物（趙彥華等，2017）。為充分了解自然界昆蟲中的微孢子蟲流行規(guī)律，本研究調(diào)查了廣西昆蟲微孢子蟲資源分布情況，并分析昆蟲微孢子蟲的感染性和分類特性，結(jié)果表明，廣西昆蟲微孢子蟲資源分布廣泛，大部分鱗翅目昆蟲存在微孢子蟲感染情況，且部分昆蟲微孢子蟲對寄主具有很強的胚種傳染性（桑尺蠖微孢子蟲和菜粉蝶微孢子蟲），說明可能存在微孢子蟲與昆蟲宿主共生或控制昆蟲自然種群密度的現(xiàn)象。此外，各種野外昆蟲的微孢子蟲自然感染率存在明顯差異，如菜粉蝶的微孢子蟲感染率達54.94%，而桑螟的微孢子蟲感染率僅0.08%，二者相差600多倍，說明自然界中存在易感微孢子蟲的特定昆蟲寄主，今后可從這些易感昆蟲收集微孢子蟲資源。

已有研究證實，昆蟲微孢子蟲可來源于Nosema sp.、Vairimorpha sp.、Thelophania sp.、Pleistophora sp.或Endoreticulatus sp.等不同屬。時連根等（1999）從桑尺蠖分離出1株Thelophania屬微孢子蟲，方定堅等（2002）從桑蘭葉甲分離出1株Vairimorpha屬微孢子蟲，萬永繼等（2005）從龍眼裳卷蛾分離出1株Vairimorpha屬微孢子蟲，楊瓊等（2007）從甜菜夜蛾分離出1株Nosema屬微孢子蟲；本課題組前期調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，從7種昆蟲分離獲得的微孢子蟲均屬于Nosema屬（黃旭華等，2012，2013）。本研究結(jié)果表明，從桑尺蠖分離獲得的3株微孢子蟲雖然為不同的微孢子蟲，但均屬于Nosema屬，與家蠶微孢子蟲同屬異種。此外，本研究通過生物試驗鑒定昆蟲微孢子蟲對家蠶的感染力，發(fā)現(xiàn)有26株昆蟲微孢子蟲可食下感染家蠶，對家蠶的交叉感染率達40.00%。Kawarabata（2003）也曾報道昆蟲微孢子蟲可通過鱗毛、蛾液、病蟲尸體等載體在自然界擴散傳播并感染新寄主?？梢?，廣西蠶區(qū)已存在野外昆蟲微孢子蟲交叉?zhèn)魅炯倚Q的現(xiàn)象，尤其是菜粉蝶、稻縱卷葉螟、桑螟等昆蟲具有與家蠶交叉感染微孢子蟲的風(fēng)險，即杜絕昆蟲微孢子蟲污染桑葉交叉感染家蠶是控制家蠶微粒子病發(fā)生的重要措施。

4 結(jié)論

在廣西各地區(qū)存在豐富的昆蟲微孢子蟲資源，種類多樣，且大部分昆蟲微孢子蟲屬于Nosema屬，與家蠶微孢子蟲親緣關(guān)系密切；部分野外昆蟲微孢子蟲還對家蠶形成交叉?zhèn)魅疚：Φ娘L(fēng)險，因此杜絕昆蟲微孢子蟲污染桑葉交叉感染家蠶是控制家蠶微粒子病發(fā)生的重要措施。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）