付松

摘要：以釀酒酵母缺陷型（Saccharomyces cerevisiae）與黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）為親本菌株，分別采用聚乙二醇（PEG）和電擊方法進行原生質(zhì)體融合。對得到的融合細胞進行木糖發(fā)酵驗證，通過檢測發(fā)酵液中乙醇的含量，篩選出1株產(chǎn)乙醇的重組酵母菌株。利用該重組酵母進行木糖、葡萄糖共發(fā)酵，發(fā)酵條件為接種量3%，發(fā)酵溫度27～30 ℃，pH 5.5～6.5，發(fā)酵組分為4%木糖、3%蛋白胨、2%酵母浸粉和12%葡萄糖，發(fā)酵周期40 h，結(jié)果重組酵母可發(fā)酵木糖，木糖消耗速率明顯低于葡萄糖，乙醇濃度為72 g/L。

關鍵詞：黏紅酵母；釀酒酵母；原生質(zhì)體融合；乙醇發(fā)酵

中圖分類號：TK6；Q939.97；Q815 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）05-0014-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.07.005

Abstract：In this paper， Saccharomyces cerevisiae and Rhodotorula glutinis were used as parent strains， and protoplast fusion was performed using polyethylene glycol （PEG） and electroporation methods. The resulting fused cells were subjected to xylose fermentation verification. By detecting the ethanol content in the fermentation broth， a high-yield recombinant yeast strain was selected. The recombinant yeast was used for the co-fermentation of xylose and glucose. The fermentation conditions were as follows： inoculation amount 3%， fermentation temperature 27～30 ℃， pH 5.5～6.5， fermentation composition of 4% xylose， 3% peptone， 2% yeast extract and 12% glucose， fermentation cycle 40 h. The experimental results showed that the recombinant yeast could ferment xylose， but the consumption rate of xylose was significantly lower than that of glucose， and the ethanol yield could reach 72 g/L.

Key words：Rhodotorula glutinis；Saccharomyces cerevisiae；Protoplast fusion；Ethanol fermentation

隨著能源的巨大需求和化石燃料的日漸枯竭，人們加快了對新能源開發(fā)的節(jié)奏?？稍偕那鍧嵭湍茉匆掖急环Q為最具發(fā)展前景的液體燃料，近幾十年來，人們不斷加深對燃料乙醇的研究，工藝技術也不斷得到優(yōu)化[1 - 2 ]。目前國內(nèi)外多采用木質(zhì)纖維為原料生產(chǎn)乙醇，但工業(yè)技術上仍存在不足和缺陷[3 ]。

木質(zhì)纖維原料通過各種物理、化學方法降解后，微生物主要以降解后的木糖和葡萄糖為碳源生產(chǎn)乙醇，而獲得能發(fā)酵木糖、穩(wěn)定遺傳并且產(chǎn)乙醇的菌株成為問題的關鍵[4 - 5 ]。黏紅酵母能發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇，但產(chǎn)量低；釀酒酵母是乙醇發(fā)酵的優(yōu)良菌株，但本身卻缺乏木糖代謝途徑。原生質(zhì)體融合為基因重組的重要手段，起源于20世紀50年代[6 ]。原生質(zhì)體融合技術采用物理或化學方法使得遺傳性狀不同的細胞進行融合，通過基因或染色體的重組，從而獲得具有雙親遺傳性狀的新菌株。

原生質(zhì)體融合是一種應用廣泛且隨機的基因重組方法，具有不受微生物種族之間的限制，克服遠緣雜交的障礙等優(yōu)點。作為一種高效育種技術，該技術在抗生素、生物乙醇菌株選育中起到了至關重要的作用。張博潤等[7 ]采用聚乙二醇（CaCl2/PEG）方法進行屬間釀酒酵母的融合，并對得到的融合子的交配型、細胞大小和含量進行檢測，證明不存在異核體，融合是穩(wěn)定的。20世紀80年代以來，Zimmermann等通過對微生物和植物原生質(zhì)體、脂質(zhì)體和動物細胞進行電場融合[8 - 11 ]，為后續(xù)電擊融合技術做了鋪墊。自然界中廣泛應用的酵母菌株為樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）和嗜單寧管囊酵母（Pachysolen tannophilus）等[12 - 14 ]。筆者采用PEG和電擊方法將釀酒酵母缺陷型和黏紅酵母融合，成功構建篩選出1株產(chǎn)乙醇的新菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）CGMCC2.704購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1292由安徽豐原生物化學股份有限公司實驗室保存并提供。

1.1.2 試劑 磷酸緩沖液（PB）：三水合磷酸氫二鉀0.87 g，磷酸二氫鉀8.34 g，蒸餾水定容至1 L。預處理劑：EDTA 0.1 g，β-巰基乙醇0.1 mL（100 mL磷酸緩沖液）。高滲磷酸緩沖液（PBS）：100 mL PB中加蔗糖17 g。蝸牛酶液：PBS配制，0.22 μm無菌過濾器過濾。CaCl2溶液：0.5 mol/L。PEG溶液：PB中加35% PEG（MW=6 000）和CaCl2 10 mmol/L 。以上溶液（除酶液）均在121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 培養(yǎng)基 YNB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、再生培養(yǎng)基。

1.2 釀酒酵母缺陷型突變株的獲得

1.2.1 菌種活化 將釀酒酵母接種于YPD斜面培養(yǎng)基上，在27～30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，重復1～2次。菌種活化后，用滅菌牙簽挑取適量釀酒酵母單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基，27～30 ℃，220 r/min，搖床培養(yǎng)14～16 h。培養(yǎng)菌體生長到對數(shù)生長期OD600=1.0～1.5時，該酵母即用作突變株。

1.2.2 菌株突變及篩選 取適量上述酵母，4 500 r/min下離心5 min收集菌體，ddH2O洗滌2次，將菌體于10 mL檸檬酸緩沖液中懸浮。添加亞硝基胍（NTG，化學誘變劑）至終濃度為120 μg/mL。室溫下?lián)u床振蕩培養(yǎng)1 h，于4 500 r/min下離心5 min收集菌體，ddH2O洗滌2次后接入100 mL YNB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3 h。之后添加制霉菌素至終濃度為25 μg/mL，于28 ℃培養(yǎng)3 h，4 500 r/min下離心5 min后收集菌體，ddH2O洗滌2次后于1 mL ddH2O中懸浮，最后將懸浮液稀釋并涂布于YNB培養(yǎng)基（含5-FOA、尿嘧啶及尿苷）上篩選缺陷型突變株。

1.3 原生質(zhì)體的制備

1.3.1 菌種活化 操作方法同1.2.1。

1.3.2 制備方法 分別將菌種營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母（S. cerevisiae CICC1292）和黏紅酵母（R. glutinis CGMCC2.704）活化，接入30 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)10～12 h后收集菌體，細胞數(shù)稀釋為1.0×10～2.0×10個/mL，ddH2O洗滌2次后加預處理劑，30 ℃保溫20～25 min后將預處理劑離心去除，再用高滲緩沖液洗滌1次，添加蝸牛酶液，于30 ℃振蕩培養(yǎng)，定點取樣微檢，停止酶解（大約90%的細胞變成原生質(zhì)體），3 000 r/min，10 min離心去酶后，2次滲透壓穩(wěn)定劑洗滌，于穩(wěn)滲劑中懸浮，備用。

1.4 原生質(zhì)體的融合、 鑒定

1.4.1 電擊融合 將2種原生質(zhì)體各取1 mL進行離心，CaCl2洗滌，Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)（5 kV/cm，25 F，200 Ω），時間30 ms。

1.4.2 PEG融合 將2種原生質(zhì)體各取1 mL進行離心，CaCl2洗滌，加入PEG-CaCl2 2 mL ，30 ℃振蕩融合30 min。用高滲緩沖液洗滌2次。

1.4.3 融合子鑒定 將電擊融合后的細胞涂布于高滲固體培養(yǎng)基（不含有尿苷、尿嘧啶）上，將PEG融合后的稀釋液涂布于再生培養(yǎng)基（不含有尿苷、尿嘧啶）上，于30 ℃下培養(yǎng)2～3 d，篩選融合子。由于營養(yǎng)缺陷型細胞不能在缺乏尿苷、尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長，原生質(zhì)體融合后即可恢復為原養(yǎng)型，即融合子能在不含尿苷、尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長。通過對其細胞體積觀察進行融合子確定。

1.5 融合子發(fā)酵木糖的篩選

將篩選得到的釀酒酵母和黏紅酵母融合子涂布于含3%木糖的YPD平板上，篩選出菌落較大的菌株，通過不斷提高木糖濃度和多次傳代培養(yǎng)，挑選較好的菌株于6%木糖的YPD平板上。2～3 d后挑取較大菌落進行木糖發(fā)酵，發(fā)酵液成分為4%木糖、3%蛋白胨、2%酵母浸粉和12%葡萄糖，通過檢測乙醇含量篩選產(chǎn)乙醇的菌株。進行多次優(yōu)化篩選，最終篩選出乙醇產(chǎn)量較高的重組菌株。

1.6 木糖、 葡萄糖共發(fā)酵

1.6.1 融合子的活化 具體操作方法同1.2.1。

1.6.2 發(fā)酵方法 取活化后的酵母，以3%的接種量進行微氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度27～30 ℃，pH 5.5～6.5，發(fā)酵組分為4%木糖、3%蛋白胨、2%酵母浸粉和12%葡萄糖，定時測定發(fā)酵液中的木糖、葡萄糖消耗量及乙醇產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備

以活化后的釀酒酵母營養(yǎng)缺陷型和黏紅酵母為親本菌株，在預處理劑、高滲緩沖液以及蝸牛酶液等一系列處理后，經(jīng)顯微鏡鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)視野范圍內(nèi)的大部分細胞體積增大，說明成功制備了原生質(zhì)體。具體形態(tài)見圖1。

2.2 融合子的篩選

將原生質(zhì)體經(jīng)電擊和PEG融合后涂布在再生培養(yǎng)基上（不含尿苷、尿嘧啶），通過觀察發(fā)現(xiàn)，融合后的細胞體積和DNA含量約為2個親本菌株的2倍，而未融合的細胞體積明顯小于已融合的細胞，說明原生質(zhì)體融合成功。融合子細胞形態(tài)見圖2。

2.3 木糖、 葡萄糖共發(fā)酵

將多次篩選得到的較大菌落的融合子，以3%接種量、發(fā)酵溫度27～30 ℃、pH 5.5～6.5，發(fā)酵液組分4%木糖、3%蛋白胨、2%酵母浸粉和12%葡萄糖為條件進行發(fā)酵，發(fā)酵周期40 h。每隔5 h進行定點取樣，檢測木糖、葡萄糖的消耗量和乙醇產(chǎn)量。

從圖3可以看出，重組酵母可在上述條件下消耗木糖，同時觀察到在30 h內(nèi)葡萄糖被全部消耗，說明木糖的消耗速率明顯低于葡萄糖，即重組酵母可發(fā)酵木糖，乙醇濃度為72 g/L。

3 結(jié)論

試驗利用釀酒酵母營養(yǎng)缺陷型與黏紅酵母為親本菌株，采用原生質(zhì)體融合技術獲得重組酵母。重組酵母既能利用木糖，又能產(chǎn)乙醇。發(fā)現(xiàn)PEG等化學誘導劑為細胞毒素，細胞融合后需立即洗滌，而電場融合沒有任何后效應。電擊融合的效率高，設備、步驟簡單。木糖發(fā)酵試驗表明，在3%接種量、發(fā)酵溫度27～30 ℃、pH 5.5～6.5，發(fā)酵液組分4%木糖、3%蛋白胨、2%酵母浸粉和12%葡萄糖的條件下可發(fā)酵木糖，乙醇濃度為72 g/L。

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（本文責編：鄭丹丹）