姚丹青,樓堅鋒,顧芹芹,劉 建,張 琪,夏建明?

(1上海市種子管理總站,上海201103;2上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院,上海200240)

簡單序列重復(Simple sequence repeat,SSR)標記是建立在PCR(Polymerase chain reaction)反應基礎之上的一種遺傳標記,相比其他常用技術(shù)具有穩(wěn)定性好、準確性高等優(yōu)點,已經(jīng)被廣泛運用于農(nóng)作物品種鑒定中。辛景樹[1]從DNA快速提取、引物篩選等技術(shù)環(huán)節(jié)進行系統(tǒng)研究,建立了完整的SSR技術(shù)體系,制作了國內(nèi)192個玉米主推品種及親本的DNA指紋圖譜,并開展了玉米種子純度與品種真實性鑒定的推廣應用。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展,鮮食玉米如糯玉米、甜玉米等的遺傳改良及新品種選育工作得到高度重視,新品種不斷涌現(xiàn),種子市場異?；钴S。近年來,鮮食玉米遺傳育種及生產(chǎn)應用發(fā)展迅速,但分子標記技術(shù)在種質(zhì)鑒定中的應用與普通玉米相比仍顯落后。本試驗利用DNA指紋圖譜技術(shù),通過選用一系列鮮食玉米SSR引物,對上海地區(qū)的32個鮮食玉米品種進行指紋標記,以期為當?shù)赜衩追N子市場的品種管理提供一種快速、有效的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用上海市2013年、2014年和2015年審定和生產(chǎn)上應用的鮮食玉米品種,共計32份(表1)。

表1 上海市鮮食玉米品種材料及來源Table 1 The materials and sources of 32 maize varieties in Shanghai

1.2 DNA提取和SSR引物篩選

所有試驗材料均采集幼苗或葉片,使用北京天根生化公司植物新型基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取,并在1.0%的瓊脂糖凝膠中進行電泳,檢測DNA質(zhì)量,電泳緩沖液為1×TAE,電壓100 V;DNA純度和濃度利用NanoDrop2000c紫外可見光譜儀(Thermo公司)進行測定,稀釋至50 ng∕μL的工作液備用,4℃冰箱儲藏。

SSR引物來源于2個方面：參考國內(nèi)外發(fā)表的文獻,選擇具有多態(tài)性的引物;自行設計,根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的SSR位點序列,利用引物設計軟件PRIMER 5.0設計。初步確定40對引物用于初篩分析。所有引物由上海生工有限公司合成。

PCR 反應體系：HotStart Mix 2 × 10 μL,Coralload 10 × 2 μL,上下游引物各 0.6 μL,50 ng∕μL 模板1 μL,ddH2O 5.8 μL,總體積為20 μL。 PCR反應程序：94℃預變性5 min;94℃變性40 s,55—60℃退火35 s,72℃延伸45 s,36個循環(huán);72℃延伸10 min,擴增產(chǎn)物4℃保存。

1.3 DNA指紋圖譜的采集及數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)分析基于QIAxcel ScreenGel 1.4版軟件,通過軟件系統(tǒng)自動對指紋的原始數(shù)據(jù)進行分析,確定每個位點的等位基因。采用NTSYS-pcv 2.11軟件進行聚類分析,構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物初篩

取表型差異較大的20個玉米品種作為引物初篩材料,對擴增產(chǎn)物進行電泳分析,根據(jù)電泳譜帶分析結(jié)果(圖1),篩選出具有一定多態(tài)性、擴增容易、擴增帶型清晰且穩(wěn)定的引物進行復篩。

2.2 引物復篩

以收集的所有玉米品種為材料,采用毛細管電泳系統(tǒng)對擴增產(chǎn)物進行檢測分析。一是分析產(chǎn)物的峰型,淘汰一些連續(xù)多峰且主峰不穩(wěn)定、高低峰不明、雜峰多等不容易分析的引物,保留較好峰形的引物(圖2);二是統(tǒng)計每個位點等位基因數(shù),并根據(jù)等位基因的頻率計算位點的多態(tài)性信息含量(PIC),保留PIC大于0.5的引物;三是考慮引物染色體均勻分布,確保每條染色體上有1個位點。品種鑒定引物組合須滿足3個要求：鑒別能力強(滿足海量品種的鑒別),數(shù)量適宜(經(jīng)濟方便),染色體分布均勻(不連鎖)。按照候選引物的PIC值以及所在的染色體進行排序,取每個染色體上PIC最高的引物作為組合基數(shù),通過遺傳聚類分析組合的鑒別能力,將收集的品種進行有效區(qū)分,最終確定適合玉米品種鑒定的候選引物25對(表2)。

圖1 利用毛細管電泳系統(tǒng)檢測引物多態(tài)性Fig.1 Detection of primer polymorphism by capillary electrophoresis

圖2 復篩引物P15的峰型和等位基因分析Fig.2 Peak type and allele analysis of rescreened primer P15

表2 適合玉米品種鑒定的候選引物的確定Table 2 Determination of candidate primers suitable for identification of maize varieties

2.3 DNA數(shù)字指紋建立

以多態(tài)性高、重復性好、帶型易區(qū)分統(tǒng)計的原則[2],確定了25對核心引物,將SSR-PCR擴增產(chǎn)物特征譜帶進行0、1數(shù)字化,建立數(shù)據(jù)庫。

表3 上海地區(qū)32個玉米品種DNA指紋數(shù)據(jù)Table 3 DNA fingerprintdata of 32 maize varieties in Shanghai

2.4 遺傳多樣性分析

圖3 32個玉米品種25對引物組合的遺傳聚類圖Fig.3 Clustering map of 25 markers on 32 maize varieties

根據(jù)25對SSR引物的擴增結(jié)果進行遺傳多樣性分析,32個玉米品種的相似系數(shù)為0.460—0.900,在遺傳相似系數(shù)為0.53時,可將32個玉米品種分為三大類群(圖3)。其中,8(‘萬彩糯3號’)、12(‘蘇珍花糯2012’)、19(‘蘇科糯3號’)、21(‘蘇珍甜糯5 號’)、22(‘滬五彩花甜糯’)聚類到第2 類群,籽粒顏色都為花色相間。在遺傳相似系數(shù)為0.64時,可將第2聚類群分為3組,第2組中的25(‘滬甜1301’)、26(‘先甜5 號’)、27(‘圣甜1 號’)、28(‘先甜90’)、29(‘滬甜1 號’)、32(‘金珠甜脆’)均為黃色籽粒、穗軸白色、花絲綠色;第3組中的10(‘申科糯1號’)、16(‘華耘黑糯501’)、15(‘天糯一號’)、20(‘荊恒一號’)、21(‘蘇珍甜糯5號’)均為糯玉米。

3 討論

主要農(nóng)作物品種審定登記制度實施以來,審定品種的數(shù)量呈逐年增多趨勢,截至2013年底,玉米審定品種數(shù)量達到6 291個[3],給品種高效管理帶來了挑戰(zhàn);隨著玉米品種資源遺傳基礎日趨狹窄及少數(shù)骨干親本被集中應用,出現(xiàn)了一批在原品種基礎上僅做細微改良的派生品種,對品種鑒定技術(shù)提出了更高的要求;市場上出現(xiàn)標簽名稱與實際包裝的種子不符等品種真實性問題,增加了種子市場監(jiān)管的難度[4]。目前,SSR標記技術(shù)在玉米、水稻等農(nóng)作物中已有廣泛運用。李新海等[5]利用SSR標記研究了21個玉米自交系的遺傳變異。劉杰等[6]采用SSR標記和雜種優(yōu)勢聚類方法分析了中國15個玉米自交系的遺傳變異,初步對雜種優(yōu)勢類群進行劃分;劉世建等[7]對四川地方玉米種質(zhì)資源進行SSR聚類分析,研究了28個玉米自交系的遺傳變異。喬志軍等[8]對180份玉米自交系親緣關系進行了分子評價。傳統(tǒng)育種多由表現(xiàn)型間接對基因型進行選擇和分類,存在很大的隨機性和盲目性。分子標記技術(shù)的發(fā)展為評價玉米種質(zhì)資源基礎及雜種優(yōu)勢利用提供了新技術(shù)和手段,同時也為構(gòu)建玉米品種指紋數(shù)據(jù)庫提供了良好的基礎。本研究選定2013年、2014年和2015年上海審定和生產(chǎn)應用的主要鮮食玉米品種,基于標準化的建庫程序和毛細管電泳檢測平臺的運用,利用SSR標記技術(shù)進行指紋圖譜采集,經(jīng)過對引物初篩,最終選用了25對玉米SSR引物對32個玉米品種進行了指紋數(shù)據(jù)分析,并構(gòu)建了DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫,為當?shù)赜衩灼贩N、真實性鑒定奠定了快速檢測的基礎,為政府的品種管理、企業(yè)的品種維權(quán)、農(nóng)民的利益維護提供強有力的技術(shù)支撐,有利于保護新品種知識產(chǎn)權(quán)和生產(chǎn)者利益,促進鮮食玉米研究及種子市場的健康發(fā)展。