趙彥敏,高海琴,甕巧云

(1張家口廣播電視大學(xué),張家口075000;2河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院,張家口075000)

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,不可避免地會(huì)受到各種非生物因素如干旱、低溫、高鹽及高溫等的脅迫,導(dǎo)致農(nóng)作物的生長(zhǎng)品質(zhì)及產(chǎn)量下降。作為植物體內(nèi)重要的逆境響應(yīng)激素之一,脫落酸(Abscisic acid,ABA)既是脅迫的誘導(dǎo)產(chǎn)物,又是脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)者,通過(guò)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng),能迅速參與到植物抗脅迫的反應(yīng)中。此外,脫落酸還參與植物生長(zhǎng)的其他環(huán)節(jié),如能促使馬鈴薯形成塊莖、抑制種子的萌發(fā)等。早期通過(guò)正向遺傳學(xué)方法篩選到一些在萌發(fā)率上對(duì) ABA不敏感的擬南芥基因,如ABI1-1、ABI2-1、ABI3、ABI4和ABI5[1-4];作為ABA信號(hào)的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ABI3基因,在植物的抗旱性和耐鹽性功能中起重要的作用[5],主要在種子里表達(dá)[2]。盡管在玉米、擬南芥、水稻等多種植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了ABI3基因的存在,但ABI3在ABA介導(dǎo)的信號(hào)通路中的作用并不清楚。為了研究ABI3基因在擬南芥抗NaCl脅迫中的作用,本試驗(yàn)檢測(cè)野生型擬南芥和ABI3基因突變體在NaCl脅迫下種子萌發(fā)率、籽苗根長(zhǎng)及其生物量的差異,以期為研究擬南芥ABI3基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col-0和ABI3基因T-DNA插入突變體abi3種子購(gòu)買于美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心(TheArabidopsisBiological Resource Center,ABRC),MS培養(yǎng)基干粉購(gòu)于北京石木易生公司,植物DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 擬南芥的培養(yǎng)

分別取擬南芥野生型(Col-0)及ABI3基因突變體(abi3)種子,在10%NaClO3中消毒5 min后,用滅菌的去離子水沖洗2遍,播種于固體MS培養(yǎng)基上。在4℃下春化3 d,轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱再培養(yǎng)7 d,分別將野生型Col-0和abi3突變體的籽苗移植于蛭石與石英砂混勻(1∶1)的花盆中,于光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2周。光照培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為22℃、相對(duì)濕度60%、光周期8 h光照∕16 h黑暗、光照強(qiáng)度3 000 lx。

1.3 純合突變體abi3的篩選和鑒定

收集上述種植的擬南芥葉片,利用植物基因組DNA提取試劑盒提取擬南芥基因組DNA。以基因組DNA為模板,利用三引物法篩選和鑒定abi3純合突變體。根據(jù)http：∕∕signal.salk.edu∕網(wǎng)站上提供的TDNA 插入位點(diǎn)信息,設(shè)計(jì)鑒定引物。 引物分別為 LBb1.3：5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’、LP：5’-TCGGTCCATGGTAGGTAACTG-3’和 RP：5’-GAGAAGATCCGACTCCAAACC-3’。 LP∕RP 和 LBb1.3∕RP 的PCR產(chǎn)物預(yù)期大小分別為1 220 bp和559—859 bp。25 μL PCR反應(yīng)體系包括：1 μL DNA模板、上述3個(gè)引物各1 μL,2×PCR Mix 12.5 μL,用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s、60℃退火2 min、72℃延伸1 min,循環(huán)35次;最后72℃延伸10 min。

1.4 野生型Col-0和abi3突變體植株ABI3基因表達(dá)量測(cè)定

分別取上述擬南芥的葉片提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,以擬南芥β-actin為內(nèi)參基因,檢測(cè)ABI3基因的表達(dá)情況?；蛱禺愋哉匆锓謩e為5’-TGAATCCGTACCAATATCCTTATG-3’和5’-TCTCGCCATCCGTTTCTTTC-3’;內(nèi)參基因β-actin的特異性引物為5’-CTCCCGCTATGTATG TCGCC-3’和5’-CAGCAAGGTCAAGACGGAGG-3’。 PCR 反應(yīng)體系：2 × dNTP mix 25 μL,正反引物(25 pmol∕μL)各1 μL,模板cDNA 2 μL,補(bǔ)水至50 μL。 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 預(yù)變性4 min;94℃變性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)35次;最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.5 NaCl脅迫對(duì)擬南芥植株的影響

擬南芥野生型Col-0和abi3突變體種子經(jīng)表面消毒后,分別播種于含有不同濃度NaCl(0 mmol∕L、100 mmol∕L、125 mmol∕L、150 mmol∕L)的 MS 培養(yǎng)基上。 觀察種子萌發(fā)情況,并于第 7 天統(tǒng)計(jì)各處理的萌芽率(以種子露白為準(zhǔn)),于第9天測(cè)定各處理的生物量(30株∕處理)。為了檢測(cè)NaCl脅迫對(duì)突變體根長(zhǎng)的影響,種子消毒后點(diǎn)種于培養(yǎng)皿進(jìn)行垂直培養(yǎng),培養(yǎng)8 d后進(jìn)行根長(zhǎng)的測(cè)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體鑒定

根據(jù)http：∕∕signal.salk.edu∕網(wǎng)站所提供的信息,可知T-DNA插入到該基因的第1個(gè)內(nèi)含子內(nèi)(圖1-A),由于T-DNA的片段較長(zhǎng),引物L(fēng)P∕RP不能將其所包含的DNA序列擴(kuò)增出來(lái)。如果是突變純合子,只能借助T-DNA上的引物與基因上的引物L(fēng)Bb1.3∕RP才能擴(kuò)出條帶,條帶大小約為500 bp;如果是突變雜合子,利用LBb1.3∕RP和LP∕RP兩對(duì)引物在DNA水平上可擴(kuò)增出2個(gè)條帶,分別約為500 bp和1 000 bp。由圖1-B可知,所檢測(cè)的突變體均為純合突變體。對(duì)初步鑒定出的純合突變體進(jìn)行RT-PCR,如圖1-C所顯示,擬南芥野生型Col-0擴(kuò)增出一條帶,約500 bp,7株突變體中只有第5株沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物。由此可見(jiàn),所檢測(cè)的7株突變體中只有1株中的ABI3基因因?yàn)門(mén)-DNA的插入而完全沉默。收集該植株的種子,用于后續(xù)ABI3基因功能的研究。

圖1 擬南芥abi3突變體的鑒定和基因表達(dá)分析Fig.1 Identification and gene expression analysis of Arabidopsis thaliana mutant abi3

由圖2可知,在無(wú)脅迫條件下,野生型Col-0及abi3突變體植株表型差異不明顯。

2.2 NaCl脅迫對(duì)abi3突變體的影響

2.2.1 NaCl脅迫對(duì)突變體種子萌發(fā)率的影響

由圖3可知,在不含NaCl的培養(yǎng)基上,擬南芥野生型Col-0和abi3突變體種子的萌發(fā)率并無(wú)顯著差異,且長(zhǎng)勢(shì)基本一致;隨著NaCl濃度的升高,abi3突變體種子的萌發(fā)率明顯受到抑制,當(dāng)NaCl濃度達(dá)到150 mmol∕L時(shí),abi3突變體種子的萌發(fā)率僅為44%,與野生型Col-0種子的萌發(fā)率存在極顯著差異。

圖2 野生型Col-0(左)和abi3突變體(右)的表型Fig.2 Phenotypes of wild type Col-0(left)and abi3 mutant(right)

圖3 不同濃度NaCl脅迫下擬南芥種子的萌發(fā)率Fig.3 Germination rate of Arabidopsis thaliana seeds under NaCl stress of different concentrations

2.2.2 NaCl脅迫對(duì)突變體生物量的影響

圖4 不同濃度NaCl脅迫下擬南芥的生物量Fig.4 Biomass of Arabidopsis thaliana plants under NaCl stress of different concentrations

如圖4所示,在不含NaCl的培養(yǎng)基上,擬南芥野生型Col-0的生物量高于abi3突變體,但二者之間的差異并不顯著;隨著NaCl濃度的升高,野生型Col-0與abi3突變體的生物量均明顯下降,但突變體下降的幅度更為顯著,當(dāng)NaCl濃度達(dá)到125 mmol∕L和150 mmol∕L時(shí),abi3突變體與野生型Col-0的生物量之間存在極顯著差異。

2.2.3 NaCl脅迫對(duì)突變體根長(zhǎng)的影響

如圖5所示,野生型Col-0與abi3突變體的根長(zhǎng)在不含NaCl的培養(yǎng)基上盡管有所不同,但二者之間的差異并不顯著;隨著NaCl濃度的升高,野生型Col-0與abi3突變體根長(zhǎng)的生長(zhǎng)均受到了抑制,突變體受抑制的程度更為顯著,當(dāng)NaCl濃度達(dá)到125 mmol∕L和150 mmol∕L時(shí),野生型Col-0與abi3突變體的根長(zhǎng)之間存在極顯著差異。

圖5 不同濃度NaCl脅迫下擬南芥植株的根長(zhǎng)Fig.5 Root length of Arabidopsis thaliana plants under NaCl stress of different concentrations

3 討論

ABA是保衛(wèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵信號(hào)因子,不僅參與生物脅迫,而且在低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫條件下也起著重要作用。普遍認(rèn)為ABA通過(guò)促進(jìn)開(kāi)放的氣孔關(guān)閉或抑制關(guān)閉的氣孔開(kāi)放,控制植物與外界進(jìn)行水分與氣體的交換,從而調(diào)節(jié)植物的代謝與生理活動(dòng)[6]。如給番茄噴施外源ABA時(shí),miR159的表達(dá)量會(huì)下調(diào),從而上調(diào)其對(duì)應(yīng)的靶基因MYB[7],而MYB基因的上調(diào)對(duì)提高植物抗逆境能力有促進(jìn)作用[8]。種子休眠的建立和維持與ABA有著密切的相關(guān)性,ABA的累積可誘導(dǎo)野生型擬南芥種子進(jìn)入休眠,并維持休眠狀態(tài),而ABA不敏感突變體(abi1和abi2)種子表現(xiàn)為輕度休眠[9-10]。本研究中,當(dāng)野生型Col-0與abi3突變體受到150 mmol∕LNaCl脅迫時(shí),abi3突變體種子的萌發(fā)率、籽苗的生物量以及根長(zhǎng)的受抑制程度顯著高于野生型Col-0,初步表明ABI3基因在擬南芥抗NaCl脅迫中起著極其重要的作用。