趙杰 岳華 茍學(xué)磊 周金燕 譚紅

（1. 中國科學(xué)院成都生物研究所 中國科學(xué)院環(huán)境與微生物重點實驗室，成都 610041；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039）

伊枯草菌素A（Iturin A）最初是從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵液中分離得到的一種環(huán)脂肽類抗生素，其結(jié)構(gòu)由一個β-脂肪酸側(cè)鏈和7個α-氨基酸殘基（L-Asn-D-Tyr-D-Asn-L-Gln-LPro-D-Asn-L-Ser-）構(gòu)成［1，2］。具有強烈的抗真菌活性［3］，并且低毒、低致敏性，能抑制西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）［4］、南部玉米葉斑病原菌（South corn leaf blight）［5］、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）［6］等多種植物病原真菌的生長，還可用于人和動物皮膚真菌病的治療［7］。因而，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥方面具有較好的應(yīng)用前景及潛在的研究價值。

近年來，國內(nèi)外對iturin A的發(fā)酵工藝進(jìn)行了大量研究，Hbid等［8］認(rèn)為較高溶氧量有利于iturin A的產(chǎn)生。Shih等［9］利用響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌 S3的發(fā)酵條件，使iturin A的產(chǎn)量達(dá)11.44702 mg/g固體濕重。金虎等［10］利用未經(jīng)處理的菜籽粉作為氮源，并以一種新型兩步葡萄糖補料方法生產(chǎn)iturin A，使iturin A產(chǎn)量達(dá)到1.12 g/L。彭文璟等［11］基于均勻設(shè)計的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，優(yōu)化iturin A的補料分批發(fā)酵條件，將iturin A效價優(yōu)化至13364.5±271.3 U/mL。這些研究雖然使iturin A產(chǎn)量得到一定的提高，但依舊未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。另有研究表明，iturin A是經(jīng)非核糖體途徑合成的環(huán)脂肽抗生素，其合成過程需要結(jié)合氨基酸以完成結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化［12］。在iturin A合成代謝途徑中，Asn、Val可作為iturin A的重要合成前體，對iturin A的合成具有促進(jìn)作用［13-14］，并且培養(yǎng)基中氨基酸的種類和含量對iturin A同系物的組成比例有影響［15］。氨基酸既可作為iturin A的結(jié)構(gòu)組分，又可作為iturin A合成酶的誘導(dǎo)物，在iturin A生物合成過程中起著關(guān)鍵性作用。因此，分析檢測iturin A發(fā)酵過程中各種游離氨基酸，可以明確培養(yǎng)基中氨基酸的種類、含量以及被利用的時間和速度，對人工有效調(diào)控發(fā)酵過程中氨基酸濃度來提高iturin A產(chǎn)量具有重要意義。

為快速、精確研究iturin A發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化，建立一種適合此樣品中游離氨基酸的測定方法至關(guān)重要。目前測定氨基酸的方法主要有氨基酸分析儀法［16］、毛細(xì)管電泳法［17］和高效液相色譜法［18］等。氨基酸分析儀因設(shè)備昂貴、用途單一導(dǎo)致其使用受限。任艷麗等［19］報道用毛細(xì)管電泳法測定枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中游離氨基酸含量，但此方法穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，無法對His、Arg、Ile和Leu進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析。而高效液相色譜（HPLC）結(jié)合柱前衍生的方法具有靈敏度高、適用性廣、且能同時準(zhǔn)確測定多種氨基酸等特點［20］，并且液相色譜儀帶有自動進(jìn)樣系統(tǒng)，是一種較為理想的氨基酸檢測方法。柱前衍生HPLC法使用的關(guān)鍵在于衍生試劑和液相色譜條件的選擇。本研究擬通過采用在室溫下能和氨基酸發(fā)生反應(yīng)，且衍生產(chǎn)物PTC-AA成分單一穩(wěn)定，衍生副產(chǎn)物對測定無干擾的異硫氰酸苯酯（PITC）［21］為柱前衍生劑，優(yōu)化HPLC檢測條件，以建立一種iturin A發(fā)酵液中游離氨基酸的快速檢測方法，提高各氨基酸的分離度，為研究iturin A發(fā)酵過程中游離氨基酸的代謝規(guī)律及調(diào)控發(fā)酵過程中氨基酸濃度提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZK8，由本實驗室從產(chǎn)自新疆阿克蘇的棉花植株上分離純化、誘變而得。

1.1.2 試劑 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：天門冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）。除半胱氨酸（Cys）濃度為1.25 μmol/mL外，其余16種氨基酸濃度均為2.5 μmol/mL，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為正亮氨酸（Nle）、異硫氰酸苯酯（PITC）以及三乙胺（TEA），以上試劑均購自天津博納艾杰爾科技有限公司；色譜級乙腈，美國霍尼韋爾公司；無水乙酸鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸、甲醇，天津市博迪化工股份有限公司；水為超純水。

1.1.3 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；5415R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-300，瑞士步琦有限公司；電子分析天平，上海梅特勒—托利多儀器有限公司；pH計，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；旋渦混合器購自上海青浦滬西儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 系列混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水將其稀釋為0.1、0.5、0.9、1.3、1.7、2.1、2.5 μmol/mL 7個濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液；三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4 mL，加乙腈8.6 mL，混勻；異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取異硫氰酸苯酯25 μL，加乙腈2 mL，混勻（密閉，4℃保存）；正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取正亮氨酸10 mg，加0.1 mol/L 鹽酸溶液10 mL溶解，混勻。

1.2.2 衍生方法 氨基酸衍生參照文獻(xiàn)［22］方法，略作修改。準(zhǔn)確量取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液200 μL，分別置于1.5 mL 的EP管中，依次加入20 μL正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液、100 μL三乙胺乙腈溶液及100 μL異硫氰酸苯酯乙腈溶液，搖勻，室溫靜置衍生1 h。衍生結(jié)束后加入400 μL正己烷，震蕩搖勻，靜置10 min，取下層溶液（PITC-AA）200 μL，用600 μL超純水稀釋，混合均勻后用0.45 μm針式過濾器過濾。

1.2.3 氨基酸色譜分析條件優(yōu)化 色譜柱：Venusil AA氨基酸分析專用柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相A：0.1 mol/L無水乙酸鈉-乙腈溶液（66：5）；流動相B：80%乙腈水溶液；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；優(yōu)化其余3個色譜條件。

1.2.3.1 流動相梯度洗脫程序的優(yōu)化 以文獻(xiàn)［23-24］中的梯度洗脫程序為基礎(chǔ)，并結(jié)合所測定各氨基酸的極性特性，多次調(diào)節(jié)流動相A、B的比例，使其隨洗脫時間連續(xù)發(fā)生改變以此連續(xù)改變流動相的極性，考察不同梯度洗脫程序?qū)旌习被岱蛛x效果的影響，以確定能在最短時間內(nèi)實現(xiàn)氨基酸最佳分離的梯度洗脫程序。

1.2.3.2 流動相pH值的優(yōu)化 配制0.1 mol/L無水乙酸鈉溶液4份，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0，加入一定體積乙腈，使無水乙酸鈉與乙腈的體積比為66∶5，過0.45 μm 濾膜，得到不同pH值的流動相A。其余色譜條件不變，混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)HPLC在不同pH值的流動相中洗脫測定，考察流動相pH值對各氨基酸分離效果的影響，以確定最佳的流動相pH值。

1.2.3.3 色譜柱溫的優(yōu)化 分別設(shè)置色譜柱溫度為25℃、30℃、35℃、40℃，其余色譜條件不變，混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)HPLC在所設(shè)定的色譜柱溫度下測定分析，考察色譜柱溫對各氨基酸分離效果的影響，以確定最佳的色譜柱溫度。

1.2.4 方法驗證

1.2.4.1 線性關(guān)系 將“1.2.1”所配制的系列混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按“1.2.2”項方法衍生處理后，在優(yōu)化后的色譜條件下經(jīng)HPLC檢測分析，以氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)Nle峰面積之比為縱坐標(biāo)，以氨基酸濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，并計算相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.2.4.2 精密度及穩(wěn)定性 取濃度為2.1 μmol/mL氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2.2”項中的衍生方法衍生處理，在優(yōu)化后的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計算氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比以及保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察方法精密度；另對同一濃度氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生處理，并于衍生處理后0、2、4、6、8、12、18、24 h依次進(jìn)樣測定，計算氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比以及保留時間的RSD值，考察方法穩(wěn)定性。

1.2.4.3 重復(fù)性 精確量取發(fā)酵0 h的iturin A發(fā)酵液6份，經(jīng)預(yù)處理及衍生后，分別進(jìn)樣測定，計算每種氨基酸濃度和RSD值。

1.2.4.4 加標(biāo)回收率 精確量取已知濃度的iturin A發(fā)酵液6份，分別加入一定濃度混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)樣品預(yù)處理及衍生后，進(jìn)行HPLC測定分析，計算回收率。

1.2.5 發(fā)酵液制備

1.2.5.1 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖 42.6 g/L，大豆蛋白胨總氮 2.0 g/L，酵母膏 0.12 g/L，MgSO4·7H2O 3.14 g/L，KH2PO43.62 g/L，pH 8.0，121℃滅菌 30 min。

1.2.5.2 搖瓶分批發(fā)酵 取一支生產(chǎn)良好的枯草芽孢桿菌ZK8斜面，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中（裝樣量為100 mL/500 mL三角瓶），150 r/min、30℃條件下震蕩培養(yǎng)20 h。然后將種子液按10%轉(zhuǎn)種量轉(zhuǎn)種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，150 r/min、30℃條件下震蕩培養(yǎng)，并于發(fā)酵開始后不同時間點取樣，取樣時間點為0、3、6、9、12、15、18、24、28、32、36、42、48、54、60 h。樣品于12 000 r/min離心10 min，取上清液，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 樣品預(yù)處理 取250 μL發(fā)酵上清液，加入1 mL無水甲醇，搖勻，靜置1 h，12 000 r/min離心10 min，吸取1 mL上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50℃水浴蒸干，最后加200 μL超純水溶解備用。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 梯度洗脫程序優(yōu)化 HPLC 色譜圖結(jié)果（圖1）顯示，不同梯度洗脫程序?qū)旌习被岱蛛x時間、分離效果有顯著影響。當(dāng)流動相B（80%乙腈）初始比例為0%，在2-15 min增加至10%、15-25 min增加至30%、25-33 min增加至45%、33-33.1 min增加至100% 時，可在35 min內(nèi)將所有氨基酸完全分離（圖1-c），與條件a（圖1-a）相比，氨基酸在色譜柱中的保留時間縮短了20 min，且Pro與雜質(zhì)峰得到有效分離，故最優(yōu)梯度洗脫程序見表1。

圖1 不同梯度洗脫程序下混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 流動相pH值優(yōu)化 HPLC在不同pH值的流動相中分離混合氨基酸的結(jié)果（圖2）顯示，當(dāng)流動相pH值為4.0、5.0時，氨基酸色譜峰重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，分離效果較差；當(dāng)流動相pH值為6.0、7.0時，所有氨基酸完全分離，并且分離度均大于1，僅Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala和Pro色譜峰有前延現(xiàn)象。在pH值6.0-7.0之間進(jìn)一步實驗后確定流動相pH值為6.4±0.1。

圖2 不同流動相pH值下氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.1.3 色譜柱溫優(yōu)化 HPLC在不同色譜柱溫度下分離混合氨基酸的結(jié)果（圖3）顯示，升高色譜柱溫有利于目標(biāo)物的分離，當(dāng)色譜柱溫上升至40℃時，各氨基酸色譜峰無明顯前延、重疊現(xiàn)象，峰型較好，且分離度均大于1.5，因此選擇40℃為最終柱溫。

圖3 不同色譜柱溫下氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2 方法驗證

2.2.1 線性關(guān)系 將系列濃度混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生處理后，在優(yōu)化后的色譜條件下經(jīng)HPLC檢測，計算分析得到各氨基酸線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍，結(jié)果見表2。16種氨基酸在一定濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，但半胱氨酸衍生物不穩(wěn)定易分解，因而只對其進(jìn)行了定性分析。

2.2.2 精密度及穩(wěn)定性 按照實驗方法測定并計算，結(jié)果見表3，各氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比以及保留時間的RSD值均在2%以內(nèi)，表明該方法波動小、精密度高，且16種氨基酸衍生物在24 h內(nèi)均具有較好穩(wěn)定性。

表2 16種氨基酸的線性關(guān)系

表3 精密度和穩(wěn)定性驗證結(jié)果

2.2.3 重復(fù)性 取0 h的iturin A發(fā)酵液6份，經(jīng)預(yù)處理及衍生后分別進(jìn)樣1次，結(jié)果見表4，各氨基酸濃度的RSD值均小于5%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.4 加標(biāo)回收率 16種氨基酸的加標(biāo)回收率在83.84%-108.02%之間，且RSD值均小于2.77%，見表4，表明該測定方法準(zhǔn)確性高，滿足分析要求。

表4 重復(fù)性和加標(biāo)回收率結(jié)果

2.3 伊枯草菌素A發(fā)酵液中游離氨基酸的動態(tài)變化分析

Iturin A發(fā)酵液樣品在優(yōu)化后的色譜條件下經(jīng)HPLC測定分析，得到樣品中各游離氨基酸的分離圖譜，見圖4。用內(nèi)標(biāo)曲線法計算各時間點樣品中16種氨基酸濃度，得到iturin A發(fā)酵過程中16種游離氨基酸濃度隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律，見圖5。

由圖5-A知，游離氨基酸總含量呈一個游離氨基酸被消耗與釋放的動態(tài)變化過程。在發(fā)酵0-15 h期間，發(fā)酵液中游離氨基酸的總含量隨著時間增加而降低，可能原因為此階段菌體生長較快，游離氨基酸被枯草芽孢桿菌大量消耗用于菌體生長，18 h后其總含量呈較明顯的上升趨勢，推測可能與培養(yǎng)基中多肽、蛋白質(zhì)不斷被分解為氨基酸有關(guān)。Iturin A于發(fā)酵3 h開始合成，隨后產(chǎn)量逐漸增加直至發(fā)酵結(jié)束。

16種游離氨基酸初始濃度各不相同，且在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。其濃度變化趨勢大致可分為三類：第一類為游離Tyr，其濃度在整個發(fā)酵過程中變化不大，見圖5-B。第二類為游離Asp、Glu、Ser、Arg、Ala、Leu、Gly、Thr、Met， 在 發(fā)酵過程中其濃度均呈下降趨勢。其中，Asp、Leu、Glu、Gly這4種氨基酸濃度在發(fā)酵0-24 h期間逐漸下降，Ser、Ala則于0-15 h間處于下降階段，之后其濃度均無明顯變化，Arg、Thr濃度在整個發(fā)酵過程中緩慢下降，Met在發(fā)酵0-28 h期間濃度迅速下降，之后其濃度小幅升高，見圖5-C。第三類是游離 His、Pro、Val、Ile、Phe、Lys，發(fā)酵過程中其濃度呈上升趨勢，其中Val的上升速率最大，見圖5-D。

圖4 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖

圖5 枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中游離氨基酸及iturin A合成代謝曲線

3 討論

在微生物發(fā)酵產(chǎn)生抗生素過程中，氨基酸與抗生素合成密切相關(guān)，且在發(fā)酵過程中添加氨基酸能促進(jìn)抗生素合成［25-27］。Iturin A作為環(huán)脂肽類抗生素，已有研究表明氨基酸對其生物合成存在影響。Besson等［28，13］考察了14種氨基酸分別作為發(fā)酵培養(yǎng)基中唯一氮源對iturin A合成的影響，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)骨架中的L-Asn是合成iturin A的最佳底物，而在L-Pro和D-Tyr中不能合成iturin A，后期采用同位素標(biāo)記α-氨基酸（Asn、Gln、Ser、Pro和Tyr）進(jìn)一步研究iturin A的生物合成，表明L-Asn可能是iturin A合成的最好前體。Hourdou等［14］研究發(fā)現(xiàn)Val是iturin A側(cè)鏈脂肪酸部分合成的前體。Iwase等［15］通過向以脫脂豆粉為氮源的培養(yǎng)基中添加不同種類氨基酸研究發(fā)現(xiàn)氨基酸種類對iturin A同系物的組成比例有影響。許錟等［29］和彭文璟等［11］研究表明在枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中添加Asp、Glu、Pro能促進(jìn)iturin A的合成，并采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）方法優(yōu)化這三種氨基酸在分批發(fā)酵中的補料濃度，使iturin A的效價達(dá)13364.5 ± 271.3 U/mL，較對照提高了34.6%。由此可見，氨基酸對iturin A的生物合成具有重要影響。采用高效、便捷的檢測手段監(jiān)測分析發(fā)酵過程中各種游離氨基酸含量的動態(tài)變化有助于深入了解iturin A的合成代謝，并可為調(diào)控iturin A發(fā)酵過程中氨基酸的濃度，提高iturin A的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

由于iturin A發(fā)酵液中含有多種游離氨基酸，這些氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)無法直接用紫外檢測器檢測［30］，并且各氨基酸的保留性質(zhì)強弱不一［31］，以及氨基和羧基的解離情況受到pH值及溫度的影響［32］。因此，需要選用一種合適的衍生劑衍生氨基酸，在最佳的條件下實現(xiàn)各氨基酸的有效分離。本研究采用高效液相色譜，以異硫氰酸苯酯（PITC）為衍生劑衍生氨基酸，對梯度洗脫程序、流動相pH和色譜柱溫3個色譜條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，使得各氨基酸在35 mim內(nèi)被完全分離，縮短了分析時間，提高了分析效率。所使用的PITC衍生劑衍生得到的氨基酸衍生物除半胱氨酸衍生物外，其余均非常穩(wěn)定，而且衍生步驟簡單，對環(huán)境要求低。與毛細(xì)管電泳法［19］相比，PITC柱前衍生高效液相色譜法可顯著改善部分氨基酸的分離度，能有效分離出的氨基酸種類（16種）比毛細(xì)管電泳（14種）法多，且準(zhǔn)確性更高，尤其更能準(zhǔn)確定性和定量分析His、Arg、Ile和Leu。該方法具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.996），靈敏度高、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、精密度和重現(xiàn)性好，適合用于iturin A發(fā)酵液中多種游離氨基酸成分和含量的測定。

4 結(jié)論

本研究采用PITC將氨基酸在柱前轉(zhuǎn)化為適于高效液相色譜分離及檢測的衍生物，并優(yōu)化了色譜條件，建立了柱前衍生高效液相色譜測定伊枯草菌素A發(fā)酵液中游離氨基酸含量的方法。該方法線性關(guān)系良好，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、分析時間短、精密度高、重復(fù)性好。同時，研究分析了伊枯草菌素A發(fā)酵過程中16種游離氨基酸濃度變化規(guī)律，為發(fā)酵過程中調(diào)控氨基酸濃度提高iturin A產(chǎn)量提供了科學(xué)依據(jù)。