李莎莎 張梁 石貴陽

（1. 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，無錫 214122；2. 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122）

經(jīng)濟和社會的日益發(fā)展使得石油消耗不斷增加，燃料乙醇已成為開發(fā)新能源的重要組成部分，而木質(zhì)纖維素被認為是生產(chǎn)燃料乙醇最理想的原料，但仍存在一些亟待解決的問題，如在稀酸水解的過程中會產(chǎn)生抑制物糠醛，它是木質(zhì)纖維素發(fā)酵的主要抑制劑［1］，它不僅能誘導(dǎo)細胞活性氧（ROS）的積累，引起線粒體、液泡膜、肌動蛋白骨架和染色質(zhì)嚴重損害，而且會降低各種代謝流關(guān)鍵酶的活性，從而抑制微生物的生長［2］。因此對微生物的糠醛耐受性機理研究受到廣泛的關(guān)注。

在低濃度的糠醛存在下，酵母可以利用原位脫毒作用將糠醛轉(zhuǎn)化為低毒性的糠醇（依賴醛還原酶）。因此，利用此機制過表達zwf1（編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶），構(gòu)建TAL1和ADH1共過表達菌株可以提高糠醛的降解率［3-4］。雖然利用基因工程、代謝工程等手段發(fā)現(xiàn)了一些可能與糠醛耐受性相關(guān)基因，為糠醛耐受性機理研究提供了基礎(chǔ)，但是微生物在抑制物的脅迫環(huán)境下發(fā)生的變化極其復(fù)雜，釀酒酵母的糠醛耐受性由多個基因相互調(diào)控，單一改變某些基因或幾個基因難以達到理想的結(jié)果［5］。

分子標記技術(shù)是以DNA序列多態(tài)性為基礎(chǔ)反映生物個體之間的差異。作為第二代分子標記的微衛(wèi)星（SSR）是由幾個堿基對作為核心單位，串聯(lián)重復(fù)形成的一類DNA序列［6］，由于核心單位重復(fù)數(shù)目的變化構(gòu)成了SSR基因座的遺傳多態(tài)性，真核生物平均每50-150 kb就存在一個微衛(wèi)星位點［7］。SSR具有分布廣泛，易于檢測，信息量大，有高度多態(tài)性并遵循孟德爾共顯性遺傳等特點［8］，已被廣泛應(yīng)用于遺傳制圖、連鎖分析、親子鑒定、物種多態(tài)性、疾病基因以及農(nóng)作物、水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)經(jīng)濟性狀的基因定位研究。Zhou等［9］采用分子標記遺傳學(xué)的研究方法，篩選與花生農(nóng)藝性狀顯著相關(guān)的SSR標記，發(fā)現(xiàn)77個SSR標記與18個農(nóng)藝性狀相關(guān)，每個性狀相關(guān)的標記數(shù)在2-16之間，以期應(yīng)用于花生農(nóng)藝性狀的分子標記輔助育種。

本研究從正向遺傳學(xué)角度來研究釀酒酵母的糠醛耐受性機制，在釀酒酵母基因組上篩選出多態(tài)性微衛(wèi)星位點對F2代群體（39株單倍體耐受/敏感型）進行遺傳差異分析，以期獲得與糠醛耐受性緊密相關(guān)的微衛(wèi)星（SSR）標記，是耐受性狀遺傳圖譜構(gòu)建以及數(shù)量性狀（QTL）精確定位的前提，同時也為釀酒酵母糠醛脅迫機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 48株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），來自實驗室保藏以及中國工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖20.0，蛋白胨 20.0，酵母粉 10.0，固體加20 g瓊脂。Mcclary培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖 1.0，KCl 1.8，NaAc 8.2，酵母膏 2.5，固體加20 g瓊脂。

1.1.3 試 劑 2×TaqDNAPCR Master Mix、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自杭州寶賽生物公司；Ex Taq Max DNA Polymerase、PMD19-T（simple）Vector、DNA Marker購自寶生物工程（大連）公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純；引物由參考文獻［10］和本實驗室前期利用SSRhunter軟件篩選獲得，均送至上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 糠醛極端耐受性親本菌株的篩選 根據(jù)Pereira等［11］的方法適當修改，將實驗室保藏的48株釀酒酵母于YPD平板中活化培養(yǎng)后，挑取少許菌轉(zhuǎn)接至新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，取樣稀釋測定各菌株的OD600nm值。將菌液稀釋至OD600nm=1，取4 μL菌懸液接種到含有不同濃度的糠醛平板上（添加至YPD固體培養(yǎng)基中終濃度分別為5、7、9、11、13、15、17、19、20、21 mmol/L），30℃培養(yǎng)，以在不含糠醛的YPD平板上生長的菌落作為對照，若在添加糠醛YPD平板上生長狀況與其相當，則為其耐受表型值；篩選得到2株糠醛耐受性表型顯著二倍體菌株，涂布在Mcclary培養(yǎng)基［12］上進行產(chǎn)孢培養(yǎng)，將單倍體菌株再一次進行表型篩選，以此獲得表型極端差異單倍體親本菌株作為親本。

1.2.2 酵母基因組的提取 （酸性玻璃珠法）接種酵母單菌落于20 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)18-24 h，取適量菌液于1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心1 min，棄上清，收集菌體；向離心管中加入與菌體量等體積酸性玻璃珠，400 μL STES溶液，400 μL 24∶1（V/V）氯仿/異戊醇；劇烈震蕩30 s，立即冰浴30 s，間隔處理重復(fù)操作10次；加入400 μL TE溶液，10 000 r/min離心10 min；吸取上清液于離心管中，加入50 μL 3 mol/L醋酸鈉，1 mL無水乙醇，混勻后于-40℃冰箱放置30 min，10 000 r/min離心10 min，棄上清；加入500 μL 75%乙醇洗滌沉淀，10 000 r/min離心10 min，棄上清；于37℃烘箱晾干乙醇，加入30 μL ddH2O溶解染色體DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20℃保存。

1.2.3 釀酒酵母單倍體交配型的PCR快速鑒定 將純化得到的單倍體菌株基因組為模板，用以下3條引物進行單倍體的快速鑒定［13］：

MAT-F：5′-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3′，MAT-α ：5′-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3′，MAT-a ：5′-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3′。

100 μL PCR 反應(yīng)體系 ：2×TaqPCR Master Mix 50 μL，加入 50 μL ddH2O，引物各 1 μL，加入 1 μL酵母染色體DNA作為模板進行擴增；PCR擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min（延伸時間根據(jù)片段長度設(shè)定，擴增速度為1 000 bp/min），30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測分別對應(yīng)配型MATa（544 bp）和MATα（404 bp），從而可快速鑒定出單倍體菌株。

1.2.4 HO基因的敲除 利用Cre-LoxP系統(tǒng)［14］對篩選出來的兩株極端表型單倍體親本進行HO基因敲除，以酵母基因組為模板PCR擴增上游HO基因同源臂（490 bp）、下游同源臂（546 bp）及以質(zhì)粒PMGKR為模板PCR擴增KanMX片段（1 697 bp）作為抗性標記，再通過降落PCR得到這3個片段的融合片段，即為HO基因敲除盒（HO-KanMX-HO）并與PMD19-T（simple）進行T/A克隆并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒。通過PEGLiAC介導(dǎo)［15］轉(zhuǎn)化酵母細胞，并對轉(zhuǎn)化子進行G418抗性平板篩選?；蚯贸嚓P(guān)引物見表1。

HO基因敲除盒PCR擴增體系（100 μL）：Ex Taq 0.5 μL，10×Ex Taq Buffer 10 μL，dNTP Mixture 8 μL， 模 板 DNA 1 μL，HOL-1 和 HOR-2 各 1 μL，ddH2O 78.5 μL 反 應(yīng) 條 件 ：95℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 min，72℃ 10 min，16℃ forever，30 個循環(huán)。

1.2.5 微衛(wèi)星標記的基因分型 根據(jù)從酵母基因組中的SSR位點設(shè)計帶有不同熒光標記特異性引物，并對篩選的兩親本菌株進行基因分型，選擇在兩親本之間具有多態(tài)性SSR位點作為標記，對兩親本雜交后獲得的F2群體（39株）進行基因型分析，PCR擴增總體系為20 μL，分別為2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物、酵母基因組各0.2 μL，ddH2O補足 20 μL。反應(yīng)條件 ：95℃ 5 min，94℃ 30 s，55-57℃ 30 s（不同引物的退火溫度不同），72℃ 30 s，35個循環(huán)，72℃ 10 min，4℃保存。PCR擴增片段經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測有無所需條帶后，送至上海睿迪生物科技有限公司檢測，采用熒光檢測系統(tǒng)（ABI 3730×1測序儀），以Liz-500為分子內(nèi)標對SSR進行精確的DNA片段分析，用Peak Scanner 1.0軟件對收集到的數(shù)據(jù)進行處理分析，獲得最終基因分型結(jié)果，具有多態(tài)性微衛(wèi)星位點引物序列見表2。

1.2.6 運用統(tǒng)計學(xué)進行差異顯著性分析 將F2群體（39株）的基因分型統(tǒng)計結(jié)果運用t檢驗分析不同位點的基因型在兩基因池中的差異顯著性，以此獲得與糠醛耐受性相關(guān)的微衛(wèi)星位點。

1.2.7 極顯著差異位點基因型的克隆與測序 將極顯著差異基因片段PCR擴增并膠回收純化，連接PMD19-T（simple）載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，挑取陽性克隆并測序。

表1 HO基因敲除引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩株極端耐受性菌株的獲得

如圖1所示，不同菌株之間具有不同的表型值，篩選對糠醛極端耐受性菌株，最大表型值達到21 mmol/L，最小表型值達到5 mmol/L，大部分菌株的表型值處在11 mmol/L-17 mmol/L。本研究選擇耐糠醛表型值為21 mmol/L的CICC 31144（二倍體）作為耐受菌株，本應(yīng)選擇耐糠醛表型值盡可能低的作為低耐性親本菌株，但由于工業(yè)釀酒酵母的產(chǎn)孢子能力退化，會影響后續(xù)實驗進行，因此選擇耐糠醛表型值為11 mmol/L CICC 1373（二倍體）作為敏感菌株，同時通過產(chǎn)孢培養(yǎng)及表型鑒定，獲得表型極端差異單倍體親本菌株P(guān)1、P2。另外，利用SPSS軟件對表型值進行描述性統(tǒng)計分析，偏度系數(shù)為-0.375，峰度系數(shù)為0.238，二者系數(shù)小于1，近似為正態(tài)分布，表明此耐受性的復(fù)雜遺傳機制是由多個基因來調(diào)控性狀。

表2 在親本中具有多態(tài)性位點的引物序列

圖1 釀酒酵母（F2）糠醛耐受性的表型值分布

2.2 單倍體分離及交配型鑒定

釀酒酵母產(chǎn)孢獲得單倍體是進行酵母遺傳學(xué)及育種極為關(guān)鍵的一步，它既是性狀遺傳分析所必需，又可為雜交作好親本的準備。將CICC 31144和CICC 1373分別進行產(chǎn)孢培養(yǎng)及單倍體分離鑒定。如圖2所示，經(jīng)1.5%凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物片段大小在544 bp為MAT-a，即泳道1-3、15-16、21-22，片段大小在 404 bp 為 MAT-α，即泳道 5-7、9-14、17-20，產(chǎn)物大小同時出現(xiàn)兩個片段時為二倍體酵母細胞，即泳道4、8。

圖2 部分單倍體交配型的PCR鑒定

2.3 HO基因敲除驗證

HO基因表達一種位點特異性內(nèi)切酶，在酵母生孢過程中將導(dǎo)致單倍體配型的交換，從而與周圍的異型孢子結(jié)合恢復(fù)為二倍體，不易分離出單倍體，需通過同源重組敲除HO基因才能有效分離出單倍體。將前期實驗構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進行PCR擴增獲得敲除盒，利用PEG-LiAC法轉(zhuǎn)化酵母細胞，并挑選G418抗性平板上的轉(zhuǎn)化子進行驗證，如圖3所示，泳道1、2片段大小在1 761 bp，為野生型HO基因，泳道3、4片段大小在2 632 bp，為突變型HO基因，泳道5、6片段為進一步驗證，排除假陽性的可能。

2.4 微衛(wèi)星多態(tài)性的篩選

根據(jù)SSR分子標記具有分布廣泛，易于檢測，高度多態(tài)性并屬于共顯性遺傳標記等遺傳特性，篩選出與目標基因緊密連鎖的分子標記并應(yīng)用于追蹤與性狀相關(guān)的功能基因或QTL的遺傳動態(tài)。通過對單倍體親本菌株的基因分型，篩選出11個具有多態(tài)性位點，擴增統(tǒng)計結(jié)果如表3所示，所選的微衛(wèi)星位點在親本中表現(xiàn)出不同的基因型，說明這些位點在雙親衍生群體中具有較高的選擇力。

圖3 HO基因敲除驗證

表3 微衛(wèi)星位點在兩株親本中擴增結(jié)果統(tǒng)計

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用多態(tài)性的位點對圖1 F2代群體表型分布在兩極端的個體基因分型，也叫選擇基因型分析，統(tǒng)計結(jié)果如表4所示，表中2P5位點有兩種基因型，在耐受菌（18株）中318 bp出現(xiàn)率為28%，333 bp出現(xiàn)率為72%，而敏感菌（21株）318 bp出現(xiàn)率為100%，333 bp出現(xiàn)率為0%，說明該位點可能存在與該性狀相關(guān)的目標基因具有一定的連鎖關(guān)系。根據(jù)表4的統(tǒng)計結(jié)果，運用t檢驗分析不同位點的基因型在兩基因池中的差異顯著性，如表5所示，2P3位點統(tǒng)計量t=1.815，顯著性P值為0.039＜0.05，具有顯著差異，2P5位點統(tǒng)計量t=3.971，顯著性P值為0.000＜0.01，達到極顯著差異，說明該位點與控制該性狀的基因具有極顯著連鎖遺傳關(guān)系。

表4 微衛(wèi)星位點在兩個極端基因池（39株）中擴增結(jié)果

表5 不同微衛(wèi)星位點上等位基因的差異顯著性檢驗

2.6 極顯著差異位點基因型的測序

將極顯著差異基因片段進行序列克隆、測序，獲得微衛(wèi)星位點差異條帶的DNA序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，該片段序列和釀酒酵母S288c基因組一段高度吻合，同源性達到100%，基因登陸號為CP020124.1，2P5位點在耐受型R菌株測序結(jié)果 為 ：5′-GATTCCGATGGCGTCTCATTGGTCAATAG TGACAATTCCCTCTCTAACATTCCATTATTCTCTTCT ACTTTTCATCGTAAGTCAGAGTCTTCCTTAGCTTCGA CATCCGTTGCACCTTCTTCTTCCTCCGAATTTGAGGT AGAAAACGAAATCTTGGAGGAAAAAAATGGATTAG CAAGTAAAATCGCACAGGCCGTCTTAAACAAGAGA ATTGGTGAAAATACTGCCAGGGAAGAGGAAGAGGA AGAAGAAGAGGAAGAAGAAGAAGAGGAAGAAGAA GAAGAAGGGAAAGAAGGAGATGCGTAGATGCCATT TACTGACGGTGAAGATACT-3′；

在敏感型S菌株測序結(jié)果為：5′-GATTCCGATG GCGTCTCATTGGTCAATAGTGACAATTCCCTCTCTA ACATTCCATTATTCTCTTCTACTTTTCATCGTAAGTC AGAGTCTTCCTTAGCTTCGACATCCGTTGCACCTTC TTCTTCCTCCGAATTTGAGGTAGAAAACGAAATCTT GGAGGAAAAAAATGGTTAGCAAGTAAAATCGCAC AGGCCGTCTTAAACAAGAGAATTGGTGAAAATACT GCCAGGGAAGAGGAAGAGGAAGAAGAAGAGGAA GAAGAAGAAGAAGGGAAAGAAGGAGATGCGTAG ATGCCATTTACTGACGGTGAAGATACT-3′。

測序結(jié)果長度與基因分型分析結(jié)果大小一致，并對上述兩種基因片段利用DNAMAN軟件進行序列比對，如圖4所示，發(fā)現(xiàn)敏感型S菌株缺少4個GAA重復(fù)單元，推測重復(fù)單元的丟失導(dǎo)致了耐受性狀相關(guān)基因的失活。

圖4 微衛(wèi)星2P5等位基因片段的序列比對

3 討論

目前對酵母糠醛耐受性研究主要利用反向遺傳學(xué)來發(fā)現(xiàn)可能與耐受抑制劑相關(guān)響應(yīng)代謝途徑的基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并對微生物進行改造（過表達或敲除）來提高耐受性［16-17］，但是此耐受性是由多個基因調(diào)控的數(shù)量性狀，需從整體水平上對酵母進行系統(tǒng)的分析并深入了解性狀的遺傳結(jié)構(gòu)。

在釀酒酵母中利用分子標記解析數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的實例應(yīng)用包括耐熱性［18］、乙醇耐受性［10］、乙酸耐受性［19］、產(chǎn)孢率［20］、抗藥物敏感［21］等抗逆性狀。本研究通過篩選出兩株表型差異二倍體菌株產(chǎn)孢培養(yǎng)獲得子一代單倍體，再一次表型測定得到兩株表型顯著差異的親本單倍體菌株，同時需要敲除HO基因獲得穩(wěn)定的單倍體，并雜交構(gòu)建子二代單倍體群體F2（200株），將控制目標性狀的基因在子代充分分離重組。本研究首次利用在酵母基因組中篩選出的多態(tài)性微衛(wèi)星（SSR）標記對F2（39株）群體進行基因分型，選擇在研究中表型性狀極端個體（即性狀的最大表達），意味著在全基因組范圍內(nèi)搜索檢測到與耐受性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座（QTL）的機會通常較高［22］，分析不同位點的基因型在兩基因池中的差異顯著性，發(fā)現(xiàn)2P5位點在耐受菌（18株）中318 bp出現(xiàn)率為28%，而敏感菌（21株）318bp出現(xiàn)率為100%，333 bp出現(xiàn)率為0%，統(tǒng)計量t=3.971（P=0.000＜0.01），達到極顯著差異水平，說明2P5位點可能與糠醛耐受性相關(guān)基因存在一定的連鎖，同時將極顯著差異基因型進行序列克隆、測序，發(fā)現(xiàn)敏感型S菌株缺少4個GAA重復(fù)單元，重復(fù)單元的丟失可能會導(dǎo)致耐受性狀相關(guān)基因的失活。尋找與目標基因緊密連鎖且不受環(huán)境影響的遺傳標記在分子設(shè)計育種方面可用來選擇有利等位基因，提高育種的準確性和預(yù)見性，后續(xù)將進一步構(gòu)建糠醛耐受性狀遺傳圖譜，并對表型性狀貢獻大的位點一一準確定位，數(shù)量性狀定位可以是基因，也可以是一段非編碼序列DNA，從而打破了僅僅從基因入手的局限性，同時可與在反向遺傳學(xué)得出的已有研究結(jié)果進行對比驗證，可能將發(fā)現(xiàn)更多的新型功能基因，從而提供在纖維素水解液中發(fā)酵產(chǎn)燃料乙醇菌株的正確改造方向。

4 結(jié)論

本研究在釀酒酵母基因組上篩選出多態(tài)性微衛(wèi)星位點對F2代群體（39株單倍體耐受/敏感型）進行遺傳差異分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個與糠醛耐受性有關(guān)的微衛(wèi)星位點，其中位點2P3在兩基因池中達到顯著差異（P=0.039＜0.05），而位點2P5達到極顯著差異（P=0.000＜0.01）。對于微衛(wèi)星位點2P5，耐受親本P1在該位點的基因型（333 bp）在子代耐受群體中出現(xiàn)率為72.2%，而敏感親本P2的基因型（318 bp）在子代敏感群體中出現(xiàn)率達100%（333 bp出現(xiàn)率為零），可能與糠醛耐受性相關(guān)基因存在一定連鎖。