黃珂 黃格格 薛滿德 龍艷 袁潛華 裴新梧

（1. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228；2. 農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

啟動(dòng)子是指DNA分子上被RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等識(shí)別并結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的區(qū)域。啟動(dòng)子在基因轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控中起著非常重要的作用［1］。啟動(dòng)子可以分為組成型、特異型和誘導(dǎo)型。組成型啟動(dòng)子廣泛用于基因工程，如花椰菜（Brassica oleracea var. botrytis）花葉病毒（Ca MV）35S啟動(dòng)子［2］、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)域的胭脂堿合成酶基因Nos啟動(dòng)子［3］、章魚(yú)堿合成酶基因Ocs啟動(dòng)子［4］、水稻 Actin1基因的 Act1啟動(dòng)子［5］和玉米Ubiquitin基因的Ubi啟動(dòng)子［6］等。其中應(yīng)用最多的35S啟動(dòng)子和Ubi啟動(dòng)子幾乎在所有植物組織的全部發(fā)育階段指導(dǎo)靶基因的表達(dá)［7］。

然而，外源基因的組成型表達(dá)并不總是適用于轉(zhuǎn)基因的研究和應(yīng)用。用于研究基因功能的組成型表達(dá)將掩蓋該基因的某些精細(xì)功能，特別是與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)的功能。外源基因的組成型表達(dá)可能在轉(zhuǎn)基因植物中引起額外的代謝負(fù)擔(dān)或能量損耗［8］。此外，在遺傳轉(zhuǎn)化中，重復(fù)使用相同的啟動(dòng)子可能引起轉(zhuǎn)基因沉默［9-11］。組織特異型啟動(dòng)子又稱為器官特異型啟動(dòng)子，它指導(dǎo)基因在植物的特定組織或器官中表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性，可以避免植物營(yíng)養(yǎng)的不必要浪費(fèi)。組織特異型啟動(dòng)子的特性使其在基因工程中成為一種重要的順式作用元件，在生物反應(yīng)器、作物品種改良、抗病、抗蟲(chóng)、抗逆等作物分子育種中廣泛應(yīng)用。

根系在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和適應(yīng)中起重要作用，同時(shí)也負(fù)責(zé)水分和營(yíng)養(yǎng)的攝取，并且對(duì)整個(gè)植物有固定和穩(wěn)定的作用［12］。普通野生稻是栽培稻的近緣祖先種，宿根繁殖，根系發(fā)達(dá)，在抗旱［13］等方面進(jìn)行了廣泛研究，但還沒(méi)有根特異表達(dá)基因和啟動(dòng)子的報(bào)道。本研究從普通野生稻基因組中克隆了根特異表達(dá)啟動(dòng)子并在擬南芥中驗(yàn)證功能，為作物分子育種提供新的調(diào)控元件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 普通野生稻和擬南芥（Columbia-0）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 載體與菌株 pBinGlyRed3載體、pBinGly-Red3-CaMV 35S-GUS載體（由本實(shí)驗(yàn)室保存），pEASY -T1 Simple克隆載體，農(nóng)桿菌 EHA105，大腸桿菌感受態(tài) Trans-T1（全式金生物技術(shù)有限公司，北京）。

1.2 方法

1.2.1 OrRSG 基因表達(dá)模式的驗(yàn)證 在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的普通野生稻轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中篩選到1個(gè) FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）值在根中較高，而在地上部分幾乎為0的基因，命名為OrRSG（Root Specific Gene）［14］。分別提取普通野生稻不同發(fā)育時(shí)期地上和地下部分的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中的OrRSG基因的CDS序列為模板，設(shè)計(jì)引物（FP ：5′ -AGAGCGGAAGCGGAGTCAC-3′，RP ：5′- AACCACCGGACCCATCAAC-3′）。 利 用 半 定 量PCR（RT-PCR）驗(yàn)證OrRSG基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，選用OsActin（No.AB047313）作為內(nèi)參 基 因（FP：TTGTGTTGGACTCTGGTGATG，RP：AAGCTCGTAGCTCTTCTCCAC）。

1.2.2 OrRSG基因啟動(dòng)子克隆及序列分析 將OrRSG 基因的 CDS序列在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，可以比對(duì)到粳稻10號(hào)染色體的LOC_Os10g31540基因上，分析普通野生稻基因組中該其因上游序列，克隆LOC_Os10g31540基因ATG上游896 bp序列為OrRSG基因的啟動(dòng)子，擴(kuò)增引物為（FP：5′-TGGCAAAGCAAGGATTGCTTA-3′；RP ：5′-CATGTATTT CAAATCAGAGTGATTATCC-3′）。反應(yīng)程序如下：①預(yù)變性：95℃，5 min；②變性：95℃，30 s；③退火：58.5℃，30 s；④延伸：72℃，1min30s；⑤總延伸：72℃，10 min；其中步驟②至④重復(fù)36個(gè)循環(huán)，置于4℃保存。將克隆得到的啟動(dòng)子序列提交到PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站進(jìn)行關(guān)鍵的元件預(yù)測(cè)。

1.2.3 OrRSGp-GUS表達(dá)載體的構(gòu)建 OrRSGp啟動(dòng)子克隆引物：FP：5′-ACGCGTAAGGGGATCCTGGC AAAGCAAGGATTGCTTA-3′；RP ：5′-GATCTACCAT GAATTCCATGTATTTCAAATCAGAGTGATTATCC-3′。將克隆自野生稻的OrRSGp序列替換 pBinGlyRed3-CaMV 35S-GUS表達(dá)載體中的CaMV 35S啟動(dòng)子序列，得到pBinGlyRed3-OrRSGp-GUS 表達(dá)載體。

1.2.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及分子鑒定 將pBinGlyR-ed3-CaMV 35S-GUS 和 pBinGlyRed3-OrRSGp-GUS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA105中，以含有35S啟動(dòng)子的pBinGlyRed3-CaMV 35S-GUS 表達(dá)載體作為對(duì)照。利用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。pBinGlyRed3-CaMV 35S-GUS和pBinGlyRed3-OrRSGp-GUS表達(dá)載體的標(biāo)記基因?yàn)镈sRed紅色熒光報(bào)告基因，收獲轉(zhuǎn)基因擬南芥的T0代種子，在綠光燈下，用紅色3D立體眼鏡挑選，挑選顯出紅光的轉(zhuǎn)基因T0代種子，干燥后種植。當(dāng)T3代幼苗長(zhǎng)至一個(gè)月左右，取所有株系葉片提取基因組DNA，在啟動(dòng)子區(qū)域和GUS基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。其中轉(zhuǎn) pBinGlyRed3-CaMV 35S-GUS表達(dá)載體T3代 幼苗 PCR 鑒定引物 為（FP：GTAAGGGATGACGCACAATCC，RP：GGTCGTGTAGATTTTCACCGG）， 轉(zhuǎn) pBinGlyRed3-OrRSGp-GUS表達(dá)載體T3代幼苗PCR鑒定引物為（FP ：5′- TGGCAAAGCAAGGATTGCTTA-3′，RP ：5′-CATGTATTTCAAATCAGAGTGATTATCC -3′）。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS定性分析 轉(zhuǎn)基因擬南芥 T3代種子點(diǎn)植在1/2MS 培養(yǎng)基上，4℃放置2 d后光照培養(yǎng)。發(fā)芽后，取 1 d、3 d、7 d、15 d和 28 d的擬南芥幼苗進(jìn)行全株GUS 染色分析［15］；另一部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥 T3代種子在培養(yǎng)基質(zhì)（蛭石：珍珠巖∶營(yíng)養(yǎng)土體積比為1∶1∶2）中培養(yǎng)，等到植株進(jìn)入生殖生長(zhǎng)后，取其成熟期根、莖、葉、花、莢果進(jìn)行 GUS 染色分析。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS定量分析 選擇4個(gè)株系的T3代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性擬南芥種子，在1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待擬南芥生長(zhǎng)30 d左右分別取其地上部分和地下部分進(jìn)行 GUS 定量檢測(cè)，GUS 定量檢測(cè)方法見(jiàn) Banerjee 等［16］。

2 結(jié)果

2.1 OrRSG基因表達(dá)模式與序列分析

利用RT-PCR 驗(yàn)證OrRSG基因在普通野生稻不同發(fā)育時(shí)期綠色組織和根部的表達(dá)，結(jié)果（圖 1）表明該基因在幼苗的根中表達(dá)，葉中不表達(dá)，在成熟期的根中表達(dá)，在地上部分不表達(dá)。

圖1 RT-PCR驗(yàn)證OrRSG基因表達(dá)模式

普通野生稻OrRSG基因序列與栽培稻基因LOC_Os10g31540的相似度為98%（571/582）。該基因位于10號(hào)染色體上，基因全長(zhǎng)899 bp，CDS長(zhǎng)度為582 bp，編碼193個(gè)氨基酸。該基因在普通野生稻馴化過(guò)程中較為保守。

2.2 OrRSG基因啟動(dòng)子克隆及序列分析

以LOC_Os10g31540基因上游896 bp片段為啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)計(jì)引物，以普通野生稻全基因組DNA為模板，克隆該片段。凝膠電泳結(jié)果（圖2）顯示目的條帶符合預(yù)期大小。

測(cè)序結(jié)果（表1）顯示，OrRSGp啟動(dòng)子與數(shù)據(jù)庫(kù)中栽培稻序列相似度為99%（889/896）。對(duì)該啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中有CAAT-box、TATA-box等主要功能元件，還有參與茉莉酸甲酯反應(yīng)的響應(yīng)元件，以及抗逆等響應(yīng)元件。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于OrRSG上游44 bp處，為A堿基（圖3）。

圖2 OrRSGp克隆片段的凝膠電泳結(jié)果

表1 OrRSGp啟動(dòng)子預(yù)測(cè)元件及其功能

2.3 OrRSGp-GUS表達(dá)載體的構(gòu)建

將2.2中克隆得到的OrGSGp 啟動(dòng)子片段與pBinGlyRed3-CaMV 35S-GUS 表達(dá)載體上的CaMV 35S啟動(dòng)子替換，構(gòu)建根特異表達(dá)啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的載體 pBinGlyRed3-OrRSGp-GUS（圖4）。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色

為驗(yàn)證OrRSGp啟動(dòng)子的表達(dá)模式，將轉(zhuǎn)OrRSGp-GUS擬南芥幼苗期的全株以及成熟期根、莖、葉、花、莢果進(jìn)行GUS染色，同時(shí)以轉(zhuǎn)CaMV 35S-GUS的陽(yáng)性株系為陽(yáng)性對(duì)照，以野生型擬南芥為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)OrRSGp-GUS擬南芥以及對(duì)照擬南芥苗期1 d、3 d、7 d、15 d、28 d的染色結(jié)果（圖5）顯示，轉(zhuǎn)OrRSGp-GUS擬南芥只在有根部顯藍(lán)色，轉(zhuǎn)CaMV 35S-GUS擬南芥全株均藍(lán)色，而野生型擬南芥中沒(méi)有著色。

轉(zhuǎn)OrRSGp-GUS擬南芥以及對(duì)照在成熟期的根、莖、葉、花以及莢果中的染色結(jié)果（圖6）顯示，轉(zhuǎn)OrRSGp-GUS擬南芥只在成熟根中顯示藍(lán)色，其它部位沒(méi)有顯示藍(lán)色；轉(zhuǎn)CaMV 35S-GUS擬南芥各組織器官中均呈現(xiàn)深藍(lán)色，而野生型各組織器官未見(jiàn)到藍(lán)色。結(jié)果表明，OrRSGp啟動(dòng)子在擬南芥中的表達(dá)模式為根特異，且在不同時(shí)期表達(dá)模式一致。

圖3 啟動(dòng)子預(yù)測(cè)元件及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

圖4 pBinGlyRed3-OrRSGp-GUS表達(dá)載體圖譜

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS定量分析

隨機(jī)挑選4個(gè)轉(zhuǎn)GUS基因擬南芥T3代株系，在1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，對(duì)地上和地下部分進(jìn)行GUS定量檢測(cè)，以轉(zhuǎn)CaMV 35S-GUS擬南芥，野生型擬南芥作為對(duì)照。

圖5 轉(zhuǎn)OrRSGp-GUS擬南芥幼苗期GUS染色

圖6 轉(zhuǎn)OrRSGp-GUS擬南芥成熟期各組織GUS染色

GUS定量結(jié)果（圖7）顯示，GUS蛋白在L4、L8、L19、L23四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的葉中含量很低，在根中含量很高，說(shuō)明OrRSGp啟動(dòng)GUS報(bào)告基因在根中特異表達(dá)，葉中不表達(dá)或表達(dá)量很低；野生型擬南芥中GUS蛋白含量在根和葉中都很低；轉(zhuǎn)CaMV 35S-GUS擬南芥在根與葉中均含量很高。

圖7 轉(zhuǎn)OrRSGp-GUS表達(dá)載體擬南芥GUS定量結(jié)果

3 討論

根系在植物生長(zhǎng)中起著重要的作用，發(fā)達(dá)的根系有助于吸收深層土壤中的水分，增加作物的抗旱性［17］。利用根特異啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因在根部特異表達(dá)，能夠促進(jìn)植物對(duì)水分與養(yǎng)分的吸收并且能夠提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受力。Jeong等［18-19］在水稻中克隆了Rcc3啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)其在水稻根系中特異表達(dá)，將抗旱基因OsNAC10分別連接到組成型啟動(dòng)子GOS2和根特異啟動(dòng)子Rcc3轉(zhuǎn)化水稻，發(fā)現(xiàn)在干旱條件下，根特異表達(dá)OsNAC10的轉(zhuǎn)基因水稻比組成型表達(dá)的產(chǎn)量顯著增高。Yu等［20］在水稻中克隆了OsEXPA17啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)其在水稻和擬南芥的根中都特異表達(dá)。Chen等［21-22］在大豆中克隆了GmPRP2啟動(dòng)子和GmTIP啟動(dòng)子，分別啟動(dòng)gus基因轉(zhuǎn)化大豆，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)啟動(dòng)子為根特異啟動(dòng)子；Rausch等［23］在馬鈴薯中克隆了StPT3啟動(dòng)子，啟動(dòng)gus基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的根部特異表達(dá)。

普通野生稻具有發(fā)達(dá)的根系，而且具有宿根繁殖特性，已在抗旱方面進(jìn)行了較為廣泛的研究。胡標(biāo)林等［24］對(duì)226份東鄉(xiāng)野生稻進(jìn)行了抗旱性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)東鄉(xiāng)野生稻在干旱脅迫下具有比栽培稻發(fā)達(dá)的根系和高的成活率，即具有更發(fā)達(dá)水分輸送系統(tǒng)。Zhang等［25］構(gòu)建了栽培稻與普通野生稻的雜交群體，進(jìn)行QTL分析，定位了12個(gè)抗旱相關(guān)位點(diǎn)，確定了含有兩個(gè)來(lái)自野生稻片段qSDT2-1 和 qSDT12-2的導(dǎo)入系IL23具有強(qiáng)大的抗旱性。Zhang等［26］通過(guò)模擬干旱，構(gòu)建了4個(gè)小RNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序分析，共篩選出231個(gè)干旱后差異表達(dá)的miRNA。Tian等［14］通過(guò)對(duì)普通野生稻干旱處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，篩選出37個(gè)根中特異表達(dá)與干旱脅迫相關(guān)的基因。

但普通野生稻啟動(dòng)子相關(guān)報(bào)道還很少，本實(shí)驗(yàn)室前期克隆了綠色組織特異表的啟動(dòng)子OrGSP，驗(yàn)證了其在擬南芥綠色組織中表達(dá)［27］。目前還未見(jiàn)根特異啟動(dòng)子的報(bào)道。本研究從普通野生稻轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中篩選得到了可能的根特異表達(dá)基因，經(jīng)比對(duì)和栽培稻中LOC_Os10g31540基因同源，克隆了該基因上游的啟動(dòng)子序列，長(zhǎng)度896 bp，包含有CAAT-box、TATA-box等主要功能元件，CGTCA-motif、TGACG-motif等參與茉莉酸甲酯反應(yīng)的響應(yīng)元件，以及抗旱、抗逆響應(yīng)元件MBS，TC-rich repeats等。還有許多其他的調(diào)控元件，如circadian參與晝夜節(jié)律調(diào)控，RY-element參與種子特異性調(diào)控等。OrRSGp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因主要在根部特異性表達(dá)，從GUS染色結(jié)果可以看出，啟動(dòng)子強(qiáng)度弱于CaMV 35S組成型啟動(dòng)子，GUS定量結(jié)果與該染色結(jié)果相符。本研究克隆得到的啟動(dòng)子長(zhǎng)度為896 bp，也有可能是由于缺少必要的增強(qiáng)子片段或者抑制子的存在而導(dǎo)致的。下一步將對(duì)其進(jìn)行延長(zhǎng)以及缺失分析，以便進(jìn)一步確定該啟動(dòng)子的關(guān)鍵作用元件。

4 結(jié)論

本研究克隆了普通野生稻啟動(dòng)子OrRSGp，在擬南芥中驗(yàn)證了其表達(dá)模式，證明該啟動(dòng)子為根特異型啟動(dòng)子，為作物分子育種提供了新的調(diào)控元件。