倪瑜 尹思淇 李會 史勁松 許正宏

（1. 江南大學(xué)藥學(xué)院，無錫 214122；2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無錫 214122）

三羥基雄甾烯酮是德國先令公司推出的第四代女用口服避孕藥有效成分屈螺酮的重要中間體［1-2］。自上市以來，“優(yōu)思明”的銷售額已占全球女用口服避孕藥的首位，使得三羥基雄甾烯酮有著較大的市場需求［3］。傳統(tǒng)的化學(xué)合成法是以醋酸去氫表雄酮作為底物來合成屈螺酮，需要反應(yīng)步驟18步［4］。此合成路線反應(yīng)條件苛刻，立體選擇性差，產(chǎn)物收率較低，并且會產(chǎn)生大量的污染物［5］。隨著微生物轉(zhuǎn)化在甾體藥物合成中的深入研究，具有將DHEA雙羥化合成三羥基雄甾烯酮的菌株已被研究者從自然界中篩選獲得，建立了生物-化學(xué)法合成屈螺酮的新工藝［6］，其中關(guān)鍵幾步采用微生物轉(zhuǎn)化法［7］。與傳統(tǒng)化學(xué)合成法相比，甾體生物轉(zhuǎn)化法具有較高的立體選擇性，轉(zhuǎn)化條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)勢［8］，被譽為“綠色化學(xué)”［9-10］。目前，轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物的分離提取通常是轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心后，用親水性有機溶劑萃取菌體，用非極性有機溶劑萃取上清液［11］，這種提取分離方式與傳統(tǒng)方法直接用乙酸乙酯萃取相比，能夠提高產(chǎn)物提取率。粗品濃縮后經(jīng)柱層析洗脫、濃縮，重結(jié)晶獲得所需純品。

本實驗室從土壤中篩選一株亞麻刺盤孢ST-1（Colletotrichumlini ST-1）菌株，可以直接催化底物DHEA 得到雙羥化產(chǎn)物 7α，15α-diOH-DHEA。本實驗首先優(yōu)化轉(zhuǎn)化液預(yù)處理的方式和萃取條件來提高產(chǎn)物提取率，進而優(yōu)化柱層析中洗脫劑種類和比例，確定綠色高效的純化條件，從而建立最適的生物法制備三羥基雄甾烯酮的分離提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 亞麻刺盤孢ST-1（Colletotrichumlini ST-1），由江南大學(xué)實驗室分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（g·L-1）：馬鈴薯200，葡萄糖 20，瓊脂20；種子培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖15，酵母粉15，豆餅粉10，玉米漿3；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖15，酵母粉15，玉米漿3。

1.1.3 主要試劑 甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、正己烷、乙腈（色譜純）、層析用硅膠（200-300目）和D101大孔吸附樹脂等試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，層析硅膠G薄板購自于武漢新技術(shù)開發(fā)有限公司，DHEA、7α，15α-diOH-DHEA購自浙江仙琚制藥股份有限公司。

1.1.4 主要儀器 DK-8D型電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠），高功率超聲波清洗器KQ-800KDE（昆山市超聲儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮有限公司），Nicolet iS10型紅外光譜儀（美國賽默飛公司），柱層析色譜（美國GRACE公司），TSQ Quantum μLtra EMR型液質(zhì)聯(lián)用儀（美國賽默飛公司），U3000分析型液相色譜（美國戴安科技公司），Aduance III全數(shù)字化核磁共振聲波儀（瑞士布魯克公司）。

1.2 方法

1.2.1 C.lini ST-1菌種的培養(yǎng) 從斜面挑取適量的菌絲體，接種于100 mL新鮮種子培養(yǎng)基（500 mL錐形瓶）中，在30℃，220 r/min的搖床上培養(yǎng)48 h。將獲得的一級種子液以10%（V/V）的接種量接入新鮮種子培養(yǎng)基中，在30℃，220 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h，獲得二級種子液。

1.2.2 C.lini ST-1菌種的轉(zhuǎn)化 二級種子液以10%（V/V）的接種量接入30 mL的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（250 mL錐形瓶）中，在30℃，220 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h后投加10 g/L的DHEA，轉(zhuǎn)化72 h。

1.2.3 產(chǎn)物7α，15α-diOH-DHEA的測定 轉(zhuǎn)化液的上清和菌絲體經(jīng)萃取復(fù)溶后，通過高效液相色譜儀（戴安U3000）測定7α，15α-diOH-DHEA質(zhì)量濃度。

7α，15α-diOH-DHEA 提 取 率（%）= 7α，15α-diOH-DHEA 的 實 際 測 得 的 含 量（g）/7α，15α-diOH-DHEA的理論含量（g）×100%。

1.2.4 轉(zhuǎn)化液的預(yù)處理 （1）加熱處理：取100 mL轉(zhuǎn)化液分別在20、40、60、80和100℃水浴鍋中放置20 min，并用等體積的乙酸乙酯對轉(zhuǎn)化液進行萃取。（2）調(diào)節(jié)pH值：取100 mL轉(zhuǎn)化液，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化液的pH值，分別調(diào)節(jié)為3、5、7、9、11，并用等體積的乙酸乙酯對轉(zhuǎn)化液進行萃取。（3）超聲處理：取100 mL轉(zhuǎn)化液，在超聲功率分別為200、300、400、500和600 W下超聲15 min，并用等體積的乙酸乙酯對轉(zhuǎn)化液進行萃取。（4）化學(xué)處理：在100 mL轉(zhuǎn)化液中加入1%-10%（V/V）乙醇-氫氧化鈉溶液（2 mol/L），混合均勻后用等體積的乙酸乙酯對轉(zhuǎn)化液進行萃取。［乙醇-氫氧化鈉溶液配制為乙醇∶氫氧化鈉溶液=1∶1（V/V）］。

1.2.5 轉(zhuǎn)化液的萃取 轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心處理后，上清液分別選擇等體積的石油醚、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷以及氯仿萃取2遍，沉淀則分別選擇等體積的甲醇、乙醇和丙酮萃取2遍。合并兩種萃取液，經(jīng)濃縮及乙腈復(fù)溶后，經(jīng)HPLC檢測分析。

1.2.6 產(chǎn)物的分離與檢測

（1）展開劑的選擇：根據(jù)溶劑的體積比，選擇二氯甲烷∶甲醇 =15∶1、10∶1、5∶1；氯仿∶甲醇 = 15∶1、10∶1、5∶1；氯仿：乙醇 = 15∶1、10∶1、5∶1；二氯甲烷∶乙醇 = 15∶1、10∶1、5∶1作為展開劑，經(jīng)薄層色譜分析，根據(jù)展開效果與展開時間，選擇最佳的展開劑。（2）硅膠的處理：將700 mL體積的硅膠浸沒于甲醇溶液中，超聲處理20 min后，將含硅膠的溶液抽濾后，烘干硅膠。（3）樣品的制備：用甲醇溶解所需的粗提物，與200-300目的硅膠混勻，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至細小顆粒，用于柱層析的分離［12］。（4）各組分的分離：選用二氯甲烷與乙醇作為流動相，流速設(shè)定為22 mL/min，按乙醇體積百分比進行梯度洗脫，程序為：1%-6%-7%-10%-100%。使用Grace RevelerisTM Flash色譜系統(tǒng)中的蒸發(fā)光散射檢測器和80 g的硅膠柱對各組分檢測與分離。根據(jù)薄層色譜分離效果及分離物質(zhì)的Rf值，確定洗脫條件。（5）洗脫組分的檢測：將不同時候出峰所對應(yīng)的洗脫液收集后，用薄層色譜進行分析，將結(jié)果相同的洗脫液合并，并通過HPLC進行測定。

1.2.7 薄層層析（TLC） 吸取5 μL粗提物在TLC板上點樣，使用氯仿∶甲醇=15∶1作為展開劑，在層析缸中展開10-16 min，吹干后用乙醇∶濃硫酸 =1∶1 的顯色劑顯色［13］。

1.2.8 高效液相分析（HPLC） 粗提物復(fù)溶于乙腈中，用0.22 μm有機濾膜過濾后通過HPLC進行測定，使用安捷倫C18反相柱（4.6×250 mm，5 μm）。HPLC條件如下：檢測波長206 nm，柱溫30℃，流動相（乙腈∶水 =7∶3），進樣量 10 μL，流速0.5 mL/min［14］。

1.2.9 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定 （1）紅外光譜分析：采用KBr壓片法制備壓片，使用Nicolet iS10型紅外光譜儀進行檢測。（2）質(zhì)譜分析：使用TSQ Quantum μLtra EMR型液質(zhì)聯(lián)用儀，模式：陽離子模式。（3）氫譜分析：使用Aduance III全數(shù)字化核磁共振聲波儀在25℃下檢測，溶劑：氘代二甲基亞砜。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)化液的預(yù)處理

通過物理法和化學(xué)法對轉(zhuǎn)化液進行預(yù)處理，改變細胞膜的通透性，使胞內(nèi)產(chǎn)物更好的出胞，從而提高提取率。圖1為轉(zhuǎn)化液預(yù)處理方式的比較結(jié)果，選取加熱處理最佳條件60℃，轉(zhuǎn)化液處理后最佳pH 8，超聲處理最佳功率500 W，以及氫氧化鈉-甲醇溶液添加量10%（V/V）。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化液pH的方式，對產(chǎn)物的提取效果作用不明顯，調(diào)節(jié)溫度和改變超聲功率對產(chǎn)物提取效果作用較小，而化學(xué)處理法能夠增大細胞壁的通透性，促進胞內(nèi)物質(zhì)釋放，故添加氫氧化鈉-甲醇溶液，處理效果最為明顯。用等體積乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液，獲得的粗品用硅膠柱進行產(chǎn)物分離，以氯仿∶甲醇=15∶1作為洗脫劑，再通過重結(jié)晶得到純品。因此，在轉(zhuǎn)化液中添加一定濃度的氫氧化鈉-乙醇溶液，具有較好的效果。

圖1 預(yù)處理效果評估

為了提高化學(xué)處理法對轉(zhuǎn)化液預(yù)處理的效果，優(yōu)化了氫氧化鈉-乙醇溶液的添加量，結(jié)果如圖2所示，添加4%（V/V）的氫氧化鈉-乙醇溶液效果最好，產(chǎn)物提取率可達85.2%。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑的選擇 產(chǎn)物的提取率與萃取劑的種類、用量等因素有關(guān)。用相應(yīng)的萃取劑分別等體積的萃取沉淀和上清各2遍，表1是優(yōu)化萃取劑種類的結(jié)果，根據(jù)提取產(chǎn)物相對百分比，結(jié)果顯示分別選用乙酸乙酯和乙醇對上清和沉淀的萃取效果最好。

2.2.2 萃取劑用量的優(yōu)化 轉(zhuǎn)化液經(jīng)預(yù)處理后，8 000 r/min離心10 min。將上清和沉淀分別用不同體積比的乙酸乙酯和乙醇萃取。將萃取液分開濃縮后，通過柱層析和重結(jié)晶分別得到了上清和沉淀中產(chǎn)物純品。結(jié)果（圖3）表明，用1.5倍體積的乙酸乙酯萃取上清，上清中產(chǎn)物的質(zhì)量達0.16 g；用2倍體積的乙醇萃取沉淀，沉淀中產(chǎn)物的質(zhì)量達0.67 g，繼續(xù)增加試劑的用量，沉淀中產(chǎn)物的質(zhì)量不再增加。為提高產(chǎn)物提取率，上清先后用1倍和0.5倍體積的乙酸乙酯萃取，而沉淀用等體積的乙醇萃取2遍。

2.3 柱層析洗脫劑的優(yōu)化

氯仿、甲醇、乙醇和二氯甲烷是極性較為相似有機溶劑，從中選取兩種溶劑，按不同體積比例混合作為的展開劑，并通過薄層色譜分析，從而選擇最適的洗脫劑配比，氯仿∶甲醇（V/V）= 5∶1、10∶1；二氯甲烷∶甲醇（V/V）= 5∶1、10∶1；氯仿∶乙醇（V/V）= 5∶1、10∶1，因其分離效果不佳，未放入圖中，其余比例結(jié)果如圖4。通過薄層色譜分析，在展開相同的長度下，通過各點的Rf值和展開時間，確定最佳的展開劑，結(jié)果如表2。

圖4-A-D中，底物、副產(chǎn)物和產(chǎn)物已經(jīng)完全分開。表2結(jié)果顯示，根據(jù)各點的Rf值，當展開劑選擇二氯甲烷∶乙醇=15∶1時，展開速度最快，展開效果也較好。因此，該比例作為柱層析的洗脫劑，綠色高效又降低環(huán)境污染。

表1 不同萃取劑對上清和沉淀的萃取效果比較

圖3 萃取劑用量對上清和沉淀中產(chǎn)物產(chǎn)量的影響

2.4 硅膠柱層析及產(chǎn)物的結(jié)晶

所用菌株亞麻刺盤孢ST-1，其底物轉(zhuǎn)化率已達97.1%，產(chǎn)物 7α，15α-diOH-DHEA 得率達 80.1%。投加10 g/L的DHEA，500 mL的轉(zhuǎn)化液經(jīng)上述最優(yōu)條件處理后，萃取后濃縮的粗品于外接硅膠柱上進行產(chǎn)物的分離純化。圖5為硅膠柱上的分離效果圖，每次上樣量約為2.4 g，上樣2次。洗脫速度為29 mL/min，A、B、C三種物質(zhì)完全分離所需時間為42 min。

圖5 粗提物的分離

圖4 不同展開劑下的TLC效果圖

表2 不同展開劑下各點的Rf值和展開時間

圖6為物質(zhì)洗脫后在TLC上的結(jié)果。23 min時收集到A峰，31-32 min時收集到B峰，34-39 min時收集到C峰，從TLC的顯色結(jié)果來看，產(chǎn)物、副產(chǎn)物與底物已被成功的分開。

由于產(chǎn)物和副產(chǎn)物極性較為接近，在分離過程中，會有少量的副產(chǎn)物混入。為了提高產(chǎn)物純度，將收集到的產(chǎn)物洗脫峰濃縮成粉末后，用乙酸乙酯復(fù)溶，并水浴加熱，使溶液達到飽和狀態(tài)，在室溫下放置1 h后，再移入-20℃冰箱中過夜。將析出的晶體烘干稱重，共計4.15 g即為所要產(chǎn)物其優(yōu)化的提取分離路線，見圖7。

圖6 不同物質(zhì)的TLC分析

圖7 三羥基雄甾烯酮提取分離流程圖

2.5 提純產(chǎn)物的鑒定

2.5.1 HPLC純度鑒定 用乙腈復(fù)溶結(jié)晶后的樣品C，通過HPLC分析（圖8），結(jié)晶后的樣品C有單一的吸收峰，且與標準品7α，15α-diOH-DHEA的出峰時間相同，初步判定樣品C為產(chǎn)物7α，15α-diOHDHEA，經(jīng)計算純度為98.1%。

2.5.2 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.5.2.1 紅外光譜分析 經(jīng)過對比分析，純化后得到的物質(zhì)C與標準品7α，15α-diOH-DHEA的特征吸收峰一致，表現(xiàn)為在1 630 cm-1處的C=C伸縮振動峰；在1 720 cm-1處的C=O伸縮振動峰；在2 900 cm-1處的R-CH3伸縮振動峰；在3 450 cm-1處的-OH伸縮振動峰（圖9）。

2.5.2.2 質(zhì)譜分析 純化得到物質(zhì)C在質(zhì)譜圖中有一個明顯的峰，MS（ESI）m/z［M+K］+為359，所以物質(zhì) C 的分子量為 320，與 7α，15α-diOH-DHEA（C19H28O4）的分子量相同（圖10）。

2.5.2.3 氫譜分析 將純化得到物質(zhì)C的氫譜與7α，15α-diOH-DHEA標準品的氫譜進行比較，出峰的位置和位移基本相同。1H-NMR圖譜，化學(xué)位移情況 ：1H NMR（400 MHz，DMSO）δ5.95（d，J = 4.1 Hz，1H），5.41（d，J = 4.8 Hz，1H），4.64（d，J =4.3 Hz，1H），4.32（d，J = 4.5 Hz，1H），4.29-4.19（m，1H），4.11（d，J = 3.4 Hz，1H），2.89（dd，J= 18.9，7.6 Hz，1H），2.31-1.99（m，2H），1.92（dd，J = 19.1，6.4 Hz，1H），1.81-1.54（m，7H），1.47-1.31（m，2H），1.25（dq，J =11.6，3.9 Hz，2H），0.99-0.92（m，1H），0.89（s，3H），0.81（s，3H）。將純化產(chǎn)物與Tatyana G等研究所得的7α，15α-OH-DHEA的1H-NMR圖譜比對也基本一致，因此物質(zhì)C的化學(xué)結(jié)構(gòu)與 7α，15α-diOH-DHEA 一致（圖 11）。

圖8 物質(zhì)C的純度分析

圖9 物質(zhì)C的紅外光譜

圖10 物質(zhì)C的質(zhì)譜圖

圖11 物質(zhì)C的核磁共振氫譜

3 討論

7α，15α-diOH-DHEA是合成甾體藥物屈螺酮的關(guān)鍵中間體，作為“優(yōu)思明”的主要成分，屈螺酮不僅具有顯著的避孕效果，還能有效控制體重，穩(wěn)定情緒［15］，改善經(jīng)前癥狀等作用［16］，具有廣闊的市場前景。生物化轉(zhuǎn)化DHEA生成7α，15α-diOHDHEA是目前工業(yè)上的主要合成方法，而目的產(chǎn)物的分離提取是決定生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素之一，因此建立一種綠色高效的分離提取工藝意義重大。

轉(zhuǎn)化液的預(yù)處理，可以使胞內(nèi)的產(chǎn)物更好的釋放到胞外，一般有物理法、化學(xué)法和酶法。酶法處理具有操作溫和，選擇性強，但缺點是酶的成本較高，極大限度的限制了大規(guī)模的生產(chǎn)。物理法通過改變轉(zhuǎn)化液溫度、pH及超聲破碎等方法來提高細胞內(nèi)物質(zhì)的釋放。但轉(zhuǎn)化液在物理法作用下產(chǎn)物提取率不佳，選用化學(xué)處理法即氫氧化鈉-乙醇溶液處理轉(zhuǎn)化液，通過增大細胞壁的通透性來提高提取率。此外，轉(zhuǎn)化液的直接萃取需要使用大量的有機溶劑［17］，而將轉(zhuǎn)化液離心后得到的上清和沉淀，分別用親水性和疏水性有機溶劑萃取，可提高提取率。

硅膠柱層析分離甾體類物質(zhì)，通常使用甲醇和氯仿作為洗脫劑，但因分離過程中洗脫劑用量較大，且氯仿和甲醇都具有毒性。因此，使用與其極性相似的二氯甲烷和乙醇來替代氯仿和和甲醇，選用二氯甲烷和乙醇作為洗脫劑后，其洗脫效果較佳，更加綠色高效，減少對環(huán)境的污染。

目前，本實驗室篩選得到的C.lini ST-1，與已報道具有將DHEA雙羥化成7α，15α-diOH-DHEA的菌株相比，轉(zhuǎn)化率較高［18］。通過對轉(zhuǎn)化液提取和粗品分離純化工藝的優(yōu)化，7α，15α-diOH-DHEA的收率達91.4%，較文獻報道有所提高［11］，其優(yōu)化的提取分離路線見圖11，將其應(yīng)用于屈螺酮的生產(chǎn)，具有重大的市場價值。

4 結(jié)論

產(chǎn)物7α，15α-diOH-DHEA分離純化過程中，通過優(yōu)化轉(zhuǎn)化液預(yù)處理的方式和萃取條件，確定最終方案為，先將4%（V/V）的氫氧化鈉-乙醇溶液添加到轉(zhuǎn)化液中，充分振蕩，經(jīng)離心后分別用2倍樣品體積的乙酸乙酯和1.5倍樣品體積的乙醇萃取上清和沉淀。洗脫劑為二氯甲烷∶乙醇 = 15∶1的混合溶液，經(jīng)梯度洗脫，底物、副產(chǎn)物和產(chǎn)物3種物質(zhì)被成功分離。分別用紅外光譜、質(zhì)譜和氫譜對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行驗證，確定產(chǎn)物為7α，15α-diOH-DHEA。雖然純化中收率有所損失，但純化收率仍達91.4%。