孫程，徐寶霞，徐珍霞，陳福生，吳仁蔚

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學與技術(shù)學院，湖北武漢 430070）

李斯特菌屬共有17個種菌[1]，只有單核細胞增生李斯特菌（以下簡稱單增李斯特菌）對人具有致病性，能引起嚴重的李斯特菌病[2]，病死率高達20%～30%，特別是對孕婦、新生兒、年老體弱和免疫缺陷的人危害更大[3～5]。它引起的散發(fā)與爆發(fā)性病例絕大多數(shù)與食品受到污染有關(guān)，一般與即食食品也包括二次污染的烹飪食物有關(guān)，已報道的有乳制品、肉制品、冷凍食品、鮮切果蔬，甚至冰激凌等[6～10]，在多個國家和地區(qū)都引起過李斯特菌食物中毒事件。該菌被世界衛(wèi)生 組織列為四大食源性病原菌之一，在美國位居微生物引起的食源性致死病例第三位，自2000年在歐洲的發(fā)病也呈逐年增高的趨勢[11]。各國政府和國際組織都制定了嚴格的食品安全限量標準[12～14]。

為了減少單增李斯特菌引起的食物中毒事件的發(fā)生，對食品和生產(chǎn)環(huán)境進行監(jiān)測是必不可少的手段。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，各種新型檢測方法和檢測試劑不斷被開發(fā)和應(yīng)用。適配體，一種能夠特異性識別靶標的新型配體，有望成為生物抗體的替代物，受到國內(nèi)外學者的高度關(guān)注。適配體是從合成的隨機寡核苷酸文庫中篩選得到的能與靶分子特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA[15,16]。無論作為治療、診斷還是檢測試劑，適配體都具有獨特的優(yōu)勢。如庫容量大；靶分子范圍廣，包括真核細胞、蛋白質(zhì)、細菌、病毒、核酸和小分子物質(zhì)等[17]；識別抗原結(jié)構(gòu)精細，可以區(qū)分結(jié)構(gòu)類似物或交叉抗原的鑒別診斷[18]；性質(zhì)穩(wěn)定，對酸堿和熱有很好的耐受性；可以連接染料、藥物、多肽、蛋白、金屬離子、抗體和酶等以滿足不同使用目的；無需使用實驗動物，可通過化學合成法無限獲取并且批次間差異小[19]。所以有關(guān)適配體篩選方法、構(gòu)效關(guān)系及其應(yīng)用方面的研究進展飛速[20～24]。

本研究以單增李斯特菌為靶標，采用全細胞SELEX技術(shù)篩選ssDNA適配體，經(jīng)序列測定、二級結(jié)構(gòu)分析，以及ELASA法進行分析，以獲得特異性好、親和力高的適配體，為開發(fā)單增李斯特菌的富集和檢測方法提供新型試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ssDNA文庫與引物

ssDNA長85 bp，兩端為引物序列，中間為隨機序列，序列為 5'-AAGGATCCGAACGCTGCTGGT AT--(N40)--AGTGTTGAGCGGCGGAATTCAT-3'。引物：引物Ⅰ5'-AAGGATCCGAACGCTGCTGGTAT-3'；

引物Ⅱ5'-CGCCGCTCAACACTGAATTCAT-3'；

引 物 Ⅲ5'-(Digoxin)AAGGATCCGAACGCTG CTGGTAT-3'；

引 物 Ⅳ5'-(Biotin)CGCCGCTCAACACTGAAT TCAT-3'。

ssDNA文庫與引物均由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（上海）合成，引物Ⅲ和引物Ⅳ分別做地高辛和生物素標記。

1.1.2 實驗用菌株

單增李斯特菌C53004-1598由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供。單增李斯特菌ATCC15313、綿羊李斯特菌（L. ivanovii）ATCC 19119、格氏李斯特菌（L. grayi）ATCC25401、英諾克李斯特菌(L. innocua)ATCC 33090、 威 爾 氏 李 斯 特 菌(L.welshimeri)ATCC35897、西李氏李斯特菌(L.seeligeri)ATCC35967均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.1.3 主要試劑

小分子量DNA純化試劑盒為美國Mobio公司產(chǎn)品；抗地高辛抗體堿性磷酸酶為Roche公司產(chǎn)品；鏈霉親和素磁珠M-280為Invitrogen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒；PCR相關(guān)試劑和pMD18-T vector均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 SELEX 篩選過程[16]

取100 μmol/L 的ssDNA 文庫6 μL 加到600 μL選擇緩沖液的EP管中，96 ℃變性5 min后立即冰浴。與108CFU/mL菌液120 μL混合后于室溫震蕩結(jié)合1 h。12000 r/min，4 ℃離心 5 min，棄上清。600 μL 選擇緩沖液重懸沉淀，重復(fù)洗滌后ssDNA與菌體結(jié)合物用 100 μL 無菌 ddH2O 于 96 ℃加熱 3 min，離心后吸取上清液獲得次級文庫，為了獲得特異性強親和力高的適配體，對篩選過程進行不斷調(diào)整（表1），同時進行反相篩選去除與EP管表面結(jié)合的ssDNA。重復(fù)上述步驟循環(huán)篩選。

表1 SELEX的篩選條件Table 1 Condition of SELEX selection

1.2.2 次級文庫的制備

1～15輪篩選過程中加熱洗脫的次級文庫引物Ⅰ和引物Ⅳ進行PCR擴增以增加產(chǎn)量，對PCR的退火溫度和模板量兩個因素進行了優(yōu)化。反應(yīng)體系為2×Taq PCR Mix 15 μL、10 μM 上下游引物各 1 μL、模板（即篩選的次級文庫）、去離子水補足體積。PCR反應(yīng)條件為 94 ℃變性 45 s，不同溫度退火 45 s，72 ℃延伸45 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)10%非變性SDS-PAGE凝膠電泳進行檢測，然后進行硝酸銀染色觀察。鏈霉親和素磁珠M-280去除互補鏈（操作過程按照說明書進行），得到ssDNA次級文庫，用于下一輪篩選。

1.2.3 次級文庫結(jié)合能力的測定[21]

篩選得到的 ssDNA次級文庫用引物Ⅲ和引物Ⅳ擴增，擴增產(chǎn)物利用M-280磁珠吸附去除生物素標記的互補鏈后，獲得地高辛標記的ssDNA，將100 pmol ssDNA 與1.6×1010CFU 單增李斯特菌在500 μL選擇緩沖液中結(jié)合 30 min，12000 r/min 4 ℃離心 5 min，棄上清。加入100 μL堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體37 ℃反應(yīng) 30 min，12000 r/min 4 ℃離心 5 min，棄上清，重復(fù)洗滌 3 次。加 100 μLρ-NPP 溶液顯色，2 mol/L氫氧化鈉100 μL終止反應(yīng)，酶標儀測定405 nm的吸光度值（A405 nm）。評價各輪篩選的次級文庫與靶標的結(jié)合能力。

1.2.4 適配體結(jié)構(gòu)分析

最終獲得的ssDNA文庫經(jīng)擴增后連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆子由生工生物有限公司測序。將測序獲得的 23條適配體序列經(jīng)DNAMAN和RNA Structure分析一級結(jié)構(gòu)的同源性和預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。

1.2.5 適配體與靶標的結(jié)合能力與特異性分析

合成23條適配體，按照1.2.3方法以ELASA法測定其與單增李斯特菌的結(jié)合能力，以及識別不同種李斯特菌與非李斯特菌的特異性。每個實驗重復(fù)3次，經(jīng)獨立樣本T檢驗，在α=0.01的水平上對適配體識別單增李斯特菌與其它細菌的特異性進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增條件的確定

圖1 PCR擴增次級文庫的反應(yīng)條件Fig.1 Reaction condition of sub-library amplification by PCR

本研究主要對 PCR擴增的退火溫度和模板量進行了優(yōu)化，結(jié)果見圖1。隨著退火溫度升高產(chǎn)物增加，至72 ℃達到最大。在ssDNA模板量為1 pmol時PCR產(chǎn)物電泳條帶整齊，沒有拖尾彌散，隨著模板量增加dsDNA沒有明顯增加，ssDNA增多，說明在當前PCR反應(yīng)體系中加入的ssDNA模板過剩。所以在本次PCR反應(yīng)體系中ssDNA模板使用量為1 pmol，反應(yīng)的退火溫度采用72 ℃。

2.2 SELEX過程次級文庫的富集

圖2 ELASA測定次級文庫的富集Fig.2 Enrichment of ssDNA sub-libraries evaluated by ELASA

圖2顯示ELASA法測得的次級文庫與單增李斯特菌結(jié)合的吸光度值。A405nm從第1輪的0.051到第15輪的0.69，提高了13.5倍，說明隨著篩選輪數(shù)的增加二者的結(jié)合能力不斷增強，特異性的適配體不斷得到富集，13輪到15輪的結(jié)果表明次級文庫的結(jié)合趨于飽和。

2.3 適配體序列及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖3 RNA Structure預(yù)測適配體二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structures of aptamers predicted by RNA Structure

測序共獲得 23條適配體，隨機序列區(qū)見表 2，DNAMAN分析適配體隨機序列非常多樣化，在隨機序列區(qū)最多有8個連續(xù)相同的堿基，如適配體10和45有相同序列-TGGCCAAC-，適配體7和32有相同序列-TTTTTTTT-，其次為適配體 29、43和 44有7個連續(xù)相同的堿基-TCGGGGA-其余適配體之間連續(xù)相同堿基序列較少。

RNA Structure進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,以自由能最低作為適配體的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些序列不同的適配體二級結(jié)構(gòu)卻相似，根據(jù)二級結(jié)構(gòu)的相似性將 23條適配體分為A、B、C3個群，取每個群自由能最低的適配體結(jié)構(gòu)作為代表（見圖3）。A群適配體所占比例最高（12/23），有口袋結(jié)構(gòu)，連續(xù)的莖環(huán)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。B群適配體所占比例最少（3/23），似乎有2個分開的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。C群（8/23）有多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，口袋結(jié)構(gòu)。

2.4 適配體與靶標的結(jié)合能力與特異性分析

ELASA法測定23條適配體與單增李斯特菌的結(jié)合能力，結(jié)果見表 2，說明經(jīng)過多輪篩選親和力較高的適配體得到富集，但不同的適配體結(jié)合能力有差異。靶標的結(jié)合能力與其二級結(jié)構(gòu)有相關(guān)性。

選取的21和35號適配體特異性分析結(jié)果見圖4，其不僅能識別篩選用菌株，而且能識別其它單增李斯特菌菌株，且相比于其它種李斯特菌、腸炎沙門氏菌、大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的識別能力差異極顯著(p＜0.01，n=3)，說明這2條適配體能特異性識別單增李斯特菌。這為特異性富集和檢測單增李斯特菌奠定重要基礎(chǔ)。

圖4 21號和35號適配體的特異性Fig.4 Specificity of aptamers Lma-21 and Lma-35

表2 適配體特性分析Table 2 The characteristic of aptamers

3 討論

3.1 全細胞SELEX是以整個真核或原核細胞作為篩選的靶標，細胞表面蛋白和一些未知的結(jié)構(gòu)都可以是適配體結(jié)合的目標。通過這種方法篩選適配體不需要對表面蛋白有太多的了解，這反而有助于發(fā)現(xiàn)用于診斷和成像的新型生物標志物[17]。而且采用全細胞作為靶標，通常細胞不固定，可以保持抗原決定簇的天然結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。該方法在篩選病原菌的適配體方面具有優(yōu)勢[25]。

3.2 雖然李斯特菌屬中只有單增李斯特菌對人具有致病性，但由于他們的生理生化特性和在環(huán)境中的存活能力相似，因此其它幾種李斯特菌的檢出可能意味著有單增李斯特菌的存在或者說明環(huán)境條件允許單增李斯特菌的存在、生長，因此一定程度上具有指征作用[26,27]。本研究在適配體篩選過程中采用全細胞作為靶標，目的是盡可能保持抗原決定簇的天然結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，而且在篩選過程中未對其它李斯特菌進行反向篩選，目的是能夠同時獲得具有屬特異性和種特異性的適配體。Lma-21和Lma-35適配體表現(xiàn)出特異性識別單增李斯特菌的能力，而李斯特菌屬特異性適配體結(jié)果將在后續(xù)進行深入研究，該研究對后續(xù)開展以適配體進行菌體富集和檢測的研究具有重要意義。 3.3 本研究獲得的適配體，通過軟件分析，序列同源性不高，分析原因可能是篩選過程使用的靶標是全細胞，菌體表面存在較多的抗原表位，而適配體識別抗原表位極為精細，甚至咖啡因和茶堿這樣的結(jié)構(gòu)類似物也能被識別[18]，這增加了與靶標結(jié)合的適配體庫的豐度，造成適配體序列同源性不高。此結(jié)果與Duan[28]的結(jié)果吻合。

3.4 在進行二級結(jié)構(gòu)分析時發(fā)現(xiàn)，一些序列不同的適配體二級結(jié)構(gòu)卻相似。Heiat等[23]也發(fā)現(xiàn)不同適配體序列可以形成相似的二級結(jié)構(gòu)，而且與靶標的親和力有差異，他們認為僅僅分析序列同源性和二級結(jié)構(gòu)都不能很好地闡明適配體與靶標的相互作用。許多學者對適配體的高級結(jié)構(gòu)進行了深入研究，普遍認為它們的分子間作用包括精密的平面疊加，特異性的氫鍵結(jié)合和分子形狀的互補等，這種識別的基本原理與許多細胞識別、生物抗體以及核酸識別是一致的[23,24]。筆者正對篩選得到的適配體高級結(jié)構(gòu)進行分析，以明確適配體識別抗原位點的分子基礎(chǔ)和核心序列，為修飾適配體，提高特異性和親和力提供參考。

4 結(jié)論

本研究以單增李斯特菌為靶標，采用全細胞SELEX技術(shù)篩選ssDNA適配體，經(jīng)序列測定和二級結(jié)構(gòu)分析表明適配體的高級結(jié)構(gòu)與其識別靶標的能力明顯相關(guān)。經(jīng)ELASA法分析，獲得了能特異性識別單增李斯特菌的適配體，且親和力高。本研究為后續(xù)開發(fā)富集和檢測方法提供了可持續(xù)獲取的基礎(chǔ)材料，彌補了生物抗體的一些不足之處。