賈愛娟，周凱，孫遠(yuǎn)明，徐振林，陳元佳，韋曉群

（1.廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東中山 528437）（2.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

氨基甲酸乙酯(EC)，又稱尿烷，是一種廣泛存在于發(fā)酵食品中的 2A級(jí)致癌物(國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)，2007年)，能夠直接導(dǎo)致人類產(chǎn)生肝癌[1,2]，主要在發(fā)酵、蒸餾、滅菌和貯藏等過程形成[3]。早在 2002年EC被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織納入重點(diǎn)監(jiān)控物質(zhì)，推薦發(fā)酵食品中EC含量不超過20 μg/L[4]。在我國(guó)和其他一些 亞洲國(guó)家，發(fā)酵醬油是一類重要的食品調(diào)味料[5]，Park在研究中指出，醬油是攝入EC的主要發(fā)酵食品，雖然致癌風(fēng)險(xiǎn)較低，但對(duì)于長(zhǎng)期大量食用人群，需要保持警惕[6,7]。因此迫切需要準(zhǔn)確了解發(fā)酵醬油中EC主要前體物質(zhì)，并對(duì)形成主要前體物質(zhì)的因素進(jìn)行有效控制。

歷年來廣東是我國(guó)醬油的主要生產(chǎn)和出口地區(qū)[8]。以“日曬夜露”特色生產(chǎn)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油因其發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)風(fēng)味醇香而成名。然而，由于獨(dú)特的原料和發(fā)酵方式，很容易形成大量EC。醬油中EC的主要前體物質(zhì)是酒精和瓜氨酸[9]，分別在酵母發(fā)酵階段和乳酸菌發(fā)酵階段大量產(chǎn)生[10]。由于酒精有助于醬油獨(dú)特的醬香風(fēng)味，控制EC的方法主要集中于控制瓜氨酸形成[11]。瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，主要由微生物通過精氨酸脫氨基途徑(ADI)形成[1]。ADI途徑只存在與少數(shù)原核生物中，醬油中的魯氏結(jié)合酵母并不能產(chǎn)生瓜氨酸[12]。在醬油發(fā)酵過程中，前期發(fā)酵的曲霉以及隨后使發(fā)酵液pH降低的乳酸菌可能成為瓜氨酸的主要來源。Zhang認(rèn)為[10]，Pediococcus acidilactici是醬油中瓜氨酸的主要來源，但在醬油發(fā)酵過程中，Weissella和Candida是優(yōu)勢(shì)菌株[13]。因此有必要深入了解醬油中的Weissella消耗精氨酸積累瓜氨酸的情況。

本研究以高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油為主要研究對(duì)象，分離了醬油乳酸發(fā)酵階段乳酸菌，確定了對(duì)瓜氨酸積累情況，并考察了環(huán)境因素Weissella confusa積累瓜氨酸的影響。為尋求有效的方法降低醬油中瓜氨酸積累，減少醬油中EC的產(chǎn)生提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

醬油曲料、醬醪和醬油發(fā)酵液來源于廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司和番禺東海調(diào)味食品有限公司兩個(gè)醬油制造廠，均為高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油，原料取回后均保存于4 ℃冰箱。

氨基甲酸乙酯(EC，99%)、9-占噸醇(98%)、氨基甲酸丁酯(BC，98%)、尿素(99%)、巴比妥酸、吡啶均為分析純，購(gòu)買于上海阿拉丁試劑公司。乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷為色譜純，購(gòu)買于RCI Labscan公司(泰國(guó))。氫氧化鈉、無水硫酸鈉和鹽酸等其他常用試劑購(gòu)買于天津希恩思生化有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氨基甲酸乙酯的測(cè)定

氨基甲酸乙酯的分離和檢測(cè)參考國(guó)標(biāo)中5009.223-2014并稍作修改，采用VF-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)色譜柱，氣相色譜質(zhì)譜型號(hào)為 Agilent 7890A-5975C(美國(guó))，色譜參數(shù)設(shè)置為：氦氣為載氣，流速為1.0 mL/min進(jìn)樣口溫度為220 ℃，氣體洗脫程序設(shè)置為初始溫度50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min加熱至180 ℃后再以40 ℃/min加熱至240 ℃，保持5 min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1.0 μL。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定為：采用點(diǎn)噴霧離子源，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃采用SIM模式掃描，特征離子為62、74和89，為了提高靈敏度選擇62為定量離子。

樣品前處理參考國(guó)標(biāo)5009.223-2014和Huang[14]并稍做修改。量取2 mL醬油及其發(fā)酵液并加入100 μL BC內(nèi)標(biāo)(1 μg/mL)混合均勻，EC提取和純化采用固相萃取法，使用CNWBOND固相萃取小柱(上海安普)，先用正己烷潤(rùn)洗，將樣品溶液加入萃取柱中，靜置10 min，用正己烷淋洗后，再用乙酸乙酯-乙醚(V/V=5:95)洗脫。將上述所得的萃取液和洗脫液收集到離心管后用氮吹儀濃縮至干，采用二氯甲烷后充分混勻溶解后定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜后供GC-MS分析。

1.2.2 尿素和pH測(cè)定

尿素含量采用輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) QB/T 4710-2014進(jìn)行測(cè)定，取稀釋后的樣品600 μL，加入400 μL的9-羥基噸氫醇(0.02 mol/L，溶于正丙醇)衍生化試劑，并加入 100 μL 1.5 mol/L 的鹽酸溶液，漩渦震蕩 1 min，避光在 25 ℃下反應(yīng) 30 min，反應(yīng)液經(jīng) 0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾后供高效液相色譜法色譜結(jié)合熒光檢測(cè)器分離檢測(cè)。以保留時(shí)間定性，采用峰面積外標(biāo)法定量。色譜柱選擇ZORBAX SB-C18柱，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為240 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為308 nm。采用PHS-25型pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值，測(cè)定前將發(fā)酵液放置于25 ℃水浴中放置20 min使溫度達(dá)到平衡。

1.2.3 瓜氨酸和精氨酸測(cè)定

瓜氨酸和精氨酸的含量參考 Zhou[15]的方法利用分光光度法稍加修改。精氨酸測(cè)定：將40 g/L NaOH、80 g/L甲萘酚和0.5 mL/L雙乙酰(用正丙醇溶解)各1 mL加入10 mL比色管中，然后加入100 μL適當(dāng)稀釋的樣品(或標(biāo)準(zhǔn)溶液)，混勻后在 30 ℃水浴中保溫 15 min，冷卻室溫后測(cè)OD540，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出精氨酸含量。瓜氨酸測(cè)定：將2 mL稀釋的樣品加入1 mL混合酸(V/V=1:3)，加入 30 g/L 二乙酰一肟 0.125 mL，混勻后避光沸水浴 30 min，繼續(xù)避光冷卻室溫后側(cè)OD490，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出瓜氨酸含量。

1.2.4 醬油中乳酸菌的分離和鑒定

將發(fā)酵醬醪用0.85%的生理鹽水梯度稀釋，取100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基中并置30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至有單菌落出現(xiàn)，將外觀不同的菌落挑出并劃線純化數(shù)次，用20%的甘油保存于-80 ℃冰箱中。將純化的菌株培養(yǎng)至OD600為1時(shí)分別接種至兩種含有和不含18%NaCl的改良MRS液體培養(yǎng)基(加入了10 g/L精氨酸)中，置于30 ℃培養(yǎng)24 h。離心后測(cè)定上清液中瓜氨酸和精氨酸含量。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根)步驟提取分離得到的菌株細(xì)菌基因組產(chǎn)物并送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16s rDNA測(cè)序分析。并在 National Center for Biotechnology Information數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上在線比對(duì)。

1.2.5Weissella confusa積累瓜氨酸的規(guī)律

挑選一株能夠大量積累瓜氨酸的Weissella confusa，分別接種至 50 mL的兩種含有和不含18%NaCl的改良MRS液體培養(yǎng)基(加入了10 g/L精氨酸)，不含有 18%NaCl的培養(yǎng)基在 30 ℃中靜置培養(yǎng)24 h，含有18%NaCl的培養(yǎng)基在30 ℃中靜置培養(yǎng)48 h，分別定時(shí)取樣測(cè)定OD值和上清中的精氨酸和瓜氨酸含量。將該菌株培養(yǎng)至 8 log cfu/mL 后取 1 mL 接種至9 mL改良的MRS培養(yǎng)基(含10 g/L精氨酸)中：不同的 NaCl濃度 6%、9%、12%、15%和 18%；不同pH 4、4.6、5.4、6.2；不同葡萄糖 0、20、40、80 g/L；不同尿素添加量5、10、20、40 mg/L；不同乙醇含量0.5%、1%、2%、4%。培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定上清液中精氨酸與瓜氨酸含量。其中不同pH組外，其余實(shí)驗(yàn)組均通過乙酸將pH調(diào)節(jié)至為6.2。除了不同的NaCl濃度組需要在 30 ℃培養(yǎng) 48 h，其他組均培養(yǎng) 24 h。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)三次。采用 SPSS statistics 19分析軟件中的ANOVA程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行差異性顯著分析。所有數(shù)據(jù)作圖均采用origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 醬油發(fā)酵過程中EC與前體物質(zhì)生成情況

圖1 醬油發(fā)酵過程中EC與尿素和瓜氨酸的相關(guān)性Fig.1 The relative of EC with urea and cirtulline during soy sauce fermentation

通過對(duì)番禺和中山兩個(gè)醬油廠的醬油發(fā)酵液中的EC含量進(jìn)行監(jiān)控，同時(shí)也在實(shí)驗(yàn)室模擬醬油發(fā)酵過程，發(fā)現(xiàn)EC在整個(gè)醬油發(fā)酵階段含量非常低(低于8 μg/L)。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中EC與瓜氨酸相關(guān)性較高，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.72，而尿素與EC的相關(guān)性很低(無法擬合，圖1)。雖然醬油中EC大量形成于淋油和滅菌階段[16]，但主要EC前體物質(zhì)瓜氨酸卻在發(fā)酵前期的乳酸發(fā)酵過程中大量積累[10,17]。EC最早出現(xiàn)在pH約為4.8時(shí)(圖1圓圈處)，此時(shí)乳酸發(fā)酵臨近結(jié)束，乙醇開始積累。在此過程中，醬油中的主要微生物為曲霉和乳酸菌。由于未在醬油曲料中檢測(cè)到EC和瓜氨酸，因此認(rèn)為曲霉新陳代謝并不能提供形成EC的主要前體物質(zhì)瓜氨酸。

2.2 乳酸菌分離與瓜氨酸積累情況

圖2 醬油中分離的乳酸菌在不含(a)和含有(b)18%NaCl的MRS培養(yǎng)基(含10 g/L精氨酸)培養(yǎng)24 h后利用精氨酸積累瓜氨酸的能力Fig.2 The arginine consumption and citrulline accumulation capacity of lactic acid bacteria isolated from the high-salt liquid-state fermented soy sauce

利用MRS固體培養(yǎng)基分離pH約為4.8中的醬醪中乳酸菌，通過對(duì)比菌落特征共得到34株菌，菌株鑒定結(jié)果與Sulaiman基本一致[13]。圖2顯示分離得到的乳酸菌在含有和不含18%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中利用精氨酸積累瓜氨酸的情況。顯然 18%NaCl脅迫下，乳酸菌積累瓜氨酸能力顯著提高[10]，精氨酸到瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率提高了 1～14倍。根據(jù)能否大量利用和基本不利用精氨酸將得到的乳酸菌大致分成兩類，基本不能利用精氨酸的菌株全部為L(zhǎng)euconostoc garlicum，這類乳酸菌雖然在含有與不含18%NaCl的培養(yǎng)基中均具有較高的瓜氨酸轉(zhuǎn)化率，但利用精氨酸能力均很差，積累瓜氨酸能力很有限，即使在18%NaCl的脅迫下，積累的瓜氨酸含量均沒有超過140 mg/L。另一類能大量消耗精氨酸，根據(jù)積累瓜氨酸情況也分成兩類：一類積累少量瓜氨酸，主要為Weissella confusa(5號(hào)和34號(hào))、Weissella cibaria、Enterococcus faecium、Weissella sp和Bacillus velezensis。另一類是大量積累瓜氨酸的菌株，主要有Pediococcus acidilactici、Weissella confusa、Leuconostoc sp、Sphingomonas echinoides和Rummeliibacillus stabekisii。其中Pediococcus acidilactici能夠在 18% NaCl的培養(yǎng)基積累最多的瓜氨酸(1682 mg/L)，且轉(zhuǎn)化率達(dá)到17.18%，但數(shù)量很少。Weissella confusa檢出數(shù)量最多，均能大量利用培養(yǎng)基中的精氨酸，但積累瓜氨酸的能力差別很大，其中5和34號(hào)的Weissella confusa在不含NaCl的培養(yǎng)基中利用精氨酸能力很差但在18% NaCl的培養(yǎng)基中能高效利用精氨酸且不積累瓜氨酸，而除5和34號(hào)的其他Weissella confusa在MRS培養(yǎng)基中均能大量利用精氨酸，在高含量的NaCl脅迫下積累瓜氨酸能力顯著提高。

2.3Weissella confusa生長(zhǎng)過程中對(duì)瓜氨酸積累情況

圖3 Weissella confusa在不含(a)和含有(b)18%NaCl的MRS(10 g/L精氨酸)培養(yǎng)基中消耗精氨酸和利用瓜氨酸的情況Fig.3 The arginine consumption and citrulline accumulation ability of Weissella confusa in cultivating with (a) and without(b) 18%NaCl MRS Medium

圖3是將挑選的一株Weissella confusa在最佳外界條件下培養(yǎng)，分別在不同時(shí)間內(nèi)測(cè)定上清液中精氨酸和瓜氨酸的情況。由圖可以看出，在沒有18%NaCl脅迫下，Weissella confusa在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)精氨酸消耗量急劇增加，一方面能夠滿足菌體自身新陳代謝和繁殖，一方面利用ADI途徑產(chǎn)物減緩環(huán)境pH值的降低[18]。由于環(huán)境適合，精氨酸含量高，精氨酸到瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期變化較小，而在培養(yǎng)24 h后，上清液瓜氨酸含量才顯著升高。而18%NaCl脅迫顯著抑制了Weissella confusa生長(zhǎng)，瓜氨酸在整個(gè)生長(zhǎng)過程中均在積累，且轉(zhuǎn)化率都在20%以上。研究認(rèn)為[15]，鹽是導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)arcB基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于arcA減少?gòu)亩斐晒习彼徂D(zhuǎn)化率提高。而瓜氨酸的釋放機(jī)制卻不清楚。在本實(shí)驗(yàn)室，推測(cè)瓜氨酸在沒有鹽脅迫下主要由后期細(xì)胞衰亡過程中釋放到環(huán)境中從而積累，在有高濃度鹽脅迫下，積累的瓜氨酸能夠持續(xù)的釋放至細(xì)胞外。

2.4 環(huán)境因素對(duì)魏斯氏菌株積累瓜氨酸的影響

分別考察了鹽、pH、葡萄糖、乙醇和尿素含量對(duì)Weissella confusa消耗瓜氨酸積累精氨酸的影響。結(jié)果顯示NaCl添加量是Weissella confusa轉(zhuǎn)化率超過10%的唯一因素，也是積累瓜氨酸的最主要的因素，這也和P. acidilactici結(jié)果一致[10]，但是，NaCl添加量為9%時(shí)，雖然精氨酸消耗量與6%NaCl時(shí)相近，但此時(shí)瓜氨酸顯著增加至最大，轉(zhuǎn)化率也為最高的58.5%。隨后隨著鹽濃度的增加，Weissella confusa生長(zhǎng)受到抑制，消耗精氨酸能力下降，轉(zhuǎn)化率也隨之下降，但在18%NaCl(醬油發(fā)酵時(shí)含鹽量)的培養(yǎng)基下，轉(zhuǎn)化率升高但瓜氨酸積累依然降低，此時(shí)瓜氨酸積累量為1333.54 mg/L。Weissella confusa在含12%～18% NaCl培養(yǎng)基下最終菌的數(shù)量基本一致，但精氨酸到瓜氨酸轉(zhuǎn)化率在15%NaCl時(shí)最小，此時(shí)單位菌體利用精氨酸能力不是最弱，但消耗瓜氨酸能力強(qiáng)。

圖4 Weissella confusa在不同條件下消耗精氨酸和利用瓜氨酸的情況Fig.4 The ability of Weissella confusa to consume arginine and accumulate citrulline in different conditions

推測(cè)在該鹽濃度對(duì)Weissella confusa的ADI途徑中精氨酸脫亞氨基酶(ADI酶)抑制強(qiáng)于12%NaCl，但對(duì)鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲?；?OTC酶)抑制又弱于18%NaCl，導(dǎo)致此時(shí)ADI/OTC酶活比例降至最低[12]，因此15%鹽濃度可做為降低Weissella confusa精氨酸到瓜氨酸轉(zhuǎn)化率的重要因素之一。在pH為4.8時(shí)，Weissella confusa消耗精氨酸能力最強(qiáng)轉(zhuǎn)化率也最高，這也和分離的醬醪pH一致，且為該菌積累瓜氨酸的最佳pH，但在pH為4時(shí)，Weissella confusa生長(zhǎng)受到抑制，轉(zhuǎn)化率不到1%。

葡萄糖對(duì)Weissella confusa積累瓜氨酸影響較大，雖然糖代謝和精氨酸的代謝相互獨(dú)立，但實(shí)驗(yàn)顯示高濃度的葡萄糖能夠提高精氨酸到瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率和瓜氨酸濃度，可能的原因是：(a)提高了菌株生長(zhǎng)速率，使得穩(wěn)定期提前；(b)也可能是影響了環(huán)境的 pH，從而影響菌體的轉(zhuǎn)化率[19]；(c)葡萄糖氧化形成的大量ATP抑制了ADI途徑在酸拮抗下產(chǎn)生ATP，導(dǎo)致瓜氨酸的積累[20]。由于醬油發(fā)酵時(shí)乙醇含量和尿素含量很低，這兩者對(duì)Weissella confusa消耗精氨酸與積累瓜氨酸均沒有顯著影響。在2%乙醇濃度和10%的尿素存在下，精氨酸到瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率為最高。

3 結(jié)論

3.1 高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油在發(fā)酵過程中EC最早出現(xiàn)在發(fā)酵液pH為4.8時(shí)，此時(shí)瓜氨酸大量積累，整個(gè)發(fā)酵過程中EC與瓜氨酸的相關(guān)性遠(yuǎn)高于尿素，證實(shí)了瓜氨酸才是醬油中主要的EC前體物質(zhì)。制曲過程沒有檢測(cè)到瓜氨酸積累和EC形成。

3.2 分離得到的乳酸菌主要分成三類。一類是不能大量消耗精氨酸同時(shí)瓜氨酸積累量很小，全部是Leuconostoc garlicum；另外兩類能大量消耗精氨酸，但積累瓜氨酸能力差異很大，除了先前報(bào)道的Pediococcus acidilactici能大量積累瓜氨酸外，Weissella confusa是分離得到的優(yōu)勢(shì)菌株，大部分能夠在18%NaCl培養(yǎng)基中大量積累瓜氨酸。

3.3 鹽脅迫是Weissella confusa積累瓜氨酸的主要因素，在含18%NaCl培養(yǎng)基中在生長(zhǎng)過程中不斷積累。Weissella confusa在9%NaCl存在下，精氨酸到瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，瓜氨酸積累最多。pH 4.8和高濃度的葡萄糖能夠提高精氨酸到瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率并積累更多的瓜氨酸。因此，消除此類乳酸菌在鹽脅迫下積累瓜氨酸的能力或?qū)a(chǎn)生的大量瓜氨酸轉(zhuǎn)化掉將有助于高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中EC含量控制。