周洋，劉姝韻，谷大海，徐志強(qiáng)，王桂瑛，王雪峰，范江平，普岳紅，朱仁俊，廖國(guó)周

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）（2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650201）

宣威火腿是云南省傳統(tǒng)名特優(yōu)產(chǎn)品，2001年獲得國(guó)家原產(chǎn)地域保護(hù)，與浙江金華火腿、江蘇如皋火腿并稱“華夏三大名腿”，名揚(yáng)海內(nèi)外，它是由在原產(chǎn)地域內(nèi)飼養(yǎng)的含有烏金豬血統(tǒng)的鮮豬后腿在原產(chǎn)地域經(jīng)過修割定形、腌制、堆碼翻壓、洗曬整形、上掛風(fēng)干、發(fā)酵制作而成[1]?；鹜仍诼L(zhǎng)的加工與腌制期間其肌肉蛋白和脂肪會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的變化與反應(yīng)，而蛋 白質(zhì)降解是火腿加工過程中重要的生化反應(yīng)，蛋白質(zhì)的降解程度會(huì)影響火腿的質(zhì)構(gòu)，產(chǎn)生的分解產(chǎn)物如肽類、氨基酸、有機(jī)酸和胺等物質(zhì)對(duì)火腿風(fēng)味物質(zhì)的形成有重要貢獻(xiàn)，而蛋白質(zhì)的降解程度會(huì)受工藝過程中溫濕度條件和產(chǎn)品中鹽分、水分的影響[2]。

蛋白質(zhì)組學(xué)始于20世紀(jì)70年代由意大利科學(xué)家O’Farrell建立起的雙向凝膠電泳技術(shù)（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）的發(fā)展[3～6]。雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)經(jīng)典技術(shù)手段，它是一種將等電聚焦電泳與十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）相結(jié)合，將蛋白質(zhì)按照等電點(diǎn)和分子量大小有效分離且分辨率更高的蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)在研究蛋白的理化性質(zhì)如等電點(diǎn)和分子量、蛋白的分離純化、蛋白表達(dá)差異的查找、與質(zhì)譜相結(jié)合的手段進(jìn)行特定蛋白的鑒定等方面具有良好的效果[7]。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，應(yīng)用該技術(shù)研究干腌火腿蛋白降解情況可以更加靈敏與準(zhǔn)確地分析火腿中較為復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物[8,9]。目前對(duì)宣威火腿蛋白質(zhì)組學(xué)的研究鮮有報(bào)道，廖國(guó)周等[10]已成功建立雙向電泳分析宣威火腿蛋白質(zhì)組的方法，本研究在此基礎(chǔ)上繼續(xù)針對(duì)宣威火腿加工過程肌肉蛋白質(zhì)的降解進(jìn)行深入研究，旨在進(jìn)一步闡明宣威火腿加工過程肌肉蛋白質(zhì)降解機(jī)理，指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐，促進(jìn)云南火腿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

宣威火腿按傳統(tǒng)工藝于宣威市宣泰火腿有限公司進(jìn)行生產(chǎn)加工，經(jīng)過選料、修整腿坯、腌制、洗腿、上掛風(fēng)干、發(fā)酵等工序。從腌制前（24 h）、腌制結(jié)束（18 d）、風(fēng)干結(jié)束（125 d）、成熟中期（250 d）、成熟結(jié)束（360 d）5個(gè)階段取樣，取樣部位為股二頭肌，每次選取5塊樣品真空包裝于-20 ℃冷凍待分析。

胎牛血清標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）、碳酸氫銨、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、Triton X-100、Brij、DTT，美國(guó) Sigma公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、三氯乙酸（TCA）、二硫蘇糖醇（DTT）、丙烯酰胺、甘氨酸、低熔點(diǎn)瓊脂糖、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）和三羥甲基氨基甲烷（Tris-base），美國(guó)Amresco公司；過硫酸銨（AP）、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）、尿素、甘油與碘乙酰胺，美國(guó)Amersham公司；胰酶、三氟乙酸與十二烷基磺酸鈉（SDS），美國(guó) Promega公司；固相pH 梯度緩沖液（IPG Buffer，pH 3.0～10.0、pH 4.0～7.0）及礦物油，美國(guó) GE公司；考馬斯亮藍(lán)（G250）與溴酚藍(lán)，美國(guó)Bio Basic；固相pH梯度干膠條（24 cm，pH 3.0～10.0、pH 4.0～7.0），美國(guó)Bio-Rad公司；甲醇與乙腈，美國(guó)Fisher公司；Z-Arg-Arg-AMc、Z-Phe-Arg-AMC和AMC，美國(guó)Bachem公司；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-18R冷凍離心機(jī)、JY96-Ⅱn超聲儀，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；765Pc紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；Ettan IPGphor Ⅲ等電聚焦電泳儀、Ettan DALTsix二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳儀，美國(guó)GE Heahhcare公司；超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；Powerlook1100凝膠掃描儀，美國(guó)Umax公司；DZF-6020真空干燥機(jī)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Autoflex speed? MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜儀，德國(guó)Bruker Dalton公司；F95S熒光分光光度計(jì)，杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司；IKA T18 basic Ultra Turrax，德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1～1.3.5均參照廖國(guó)周等[10]的方法進(jìn)行。

1.3.1 蛋白質(zhì)的提取及純化

取1 g剪碎的宣威火腿肉樣放入經(jīng)預(yù)冷過的研缽中，用液氮研磨成粉，放入15 mL離心管，加入10倍體積-20 ℃預(yù)冷的10%TCA/丙酮溶液，渦旋30 s，-20 ℃沉降過夜，隨后在4 ℃、12000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀物加預(yù)冷丙酮洗滌，在 4 ℃、12000 r/min離心15 min，重復(fù)2次，沉淀經(jīng)真空干燥后，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

稱取蛋白質(zhì)干粉20 mg，加0.5 mL裂解液（含1 mmol/L PMSF，7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4%CHAPs，0.02 mol/L Tris-bases），在 20 ℃～37 ℃的條件下超聲裂解 30 min，將超聲后的蛋白混合物于4 ℃，12000 r/min，離心 20 min，收集上清液。以蛋白質(zhì)裂解液為空白，BAS標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，通過Brafford法[9]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 雙向電泳

1.3.3.1 等電聚焦

等電聚焦電泳參照 IPGphor Ⅲ等電聚焦系統(tǒng)使用指南進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出1200 μg宣威火腿蛋白上樣量體積為218.58 μL，與水化液（含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、1%DTT、0.7%IPG緩沖液、0.002%溴酚藍(lán)）充分混合后至上樣總體積為460 μL。非線性 IPG 預(yù)制膠條 pH 值范圍分別為3.0～10.0和4.0～7.0，IPG干膠條膠面朝下放入水化液，覆蓋一層礦物油防止等電聚焦時(shí)尿素析出、蛋白氧化及產(chǎn)生冷凝水，置于Ettan IPGphor等電聚焦儀中，重泡脹和等電聚焦均在20 ℃進(jìn)行，每根膠條限流50 μA。

1.3.3.2 膠條平衡

等電聚焦完畢后，膠條先在8 mL平衡緩沖液Ⅰ（含 0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.8，6 mol/L 尿素，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚藍(lán)，0.1 mol/L DTT）中平衡15 min，再在8 mL平衡緩沖液Ⅱ（以0.25 mol/L碘乙酰胺替換0.1 mol/L DTT，其余組分同平衡緩沖液Ⅰ）中平衡15 min。

1.3.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移至濃度12.5%的凝膠上端，使IPG膠條與凝膠上端緊密貼合，排盡氣泡后，用0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖封頂，待瓊脂糖凝固后即可進(jìn)行第二向SDS凝膠電泳。電泳參數(shù)設(shè)置：2 W/gel，運(yùn)行45 min，然后17 W/gel，直至溴酚藍(lán)指示線跑至膠底緣時(shí)電泳結(jié)束，約4.5 h。IPG膠條的最大電流為50 μA/gel，凝膠厚度為 1 mm。

1.3.4 染色與圖像分析

電泳結(jié)束后剝離凝膠，置于考馬斯亮藍(lán)溶液中固定染色 pi。圖像分析采用 imageMaster 2D platinum 5.0軟件進(jìn)行。

1.3.5 質(zhì)譜樣品制備與質(zhì)譜分析

切下目的蛋白點(diǎn)，將膠塊切成約1 mm3大小，用50%甲醇洗膠塊脫掉考馬斯亮藍(lán)，并以100%乙腈覆蓋膠塊至白色，接著用0.1 mol/L NH4HCO3泡脹，然后反復(fù)用50%乙腈洗至無色，干燥后加入胰酶冰水孵育30 min，吸掉多余胰酶后加入覆蓋液（含10%乙腈，0.05 mol/L NH4HCO3），37 ℃下酶切 12～16 h。酶切完的膠粒超聲處理15 min，以60 μL抽提液（含90%乙腈，2.5%三氟乙酸）對(duì)膠粒進(jìn)行脫水，吸出上清液并真空干燥，點(diǎn)樣前加入1.5 μL重溶液（30%乙腈含0.1%三氟乙酸）溶解樣品，點(diǎn)樣后當(dāng)液滴揮發(fā)到原體積的1/3左右時(shí)，加入0.5 μL基質(zhì)在樣品上，待完全干燥后即可分析。

制備的樣品使用 Autoflex speed? MALDI-TOF/ TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，激光波長(zhǎng)355 nm，重復(fù)速率為200 Hz，加速電壓為20 kV，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1500 u。掃描質(zhì)量范圍為700～3200 u，收集信號(hào)。胰酶自切峰為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜儀。試驗(yàn)樣品以默認(rèn)模式獲得肽質(zhì)量指紋圖譜。利用軟件flex Analysis過濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰，以BioTools軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時(shí)查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。

1.3.6 肌肉組織蛋白酶活力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11,12]的方法，肌肉組織蛋白酶B和L的提?。簩⒓∪鈽悠酚? ℃下解凍，剔除可見脂肪和結(jié)締組織，用絞肉機(jī)絞碎，稱5 g（精確到0.001 g），加入35 mL提取緩沖液（50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH 5.0，含 100 mmol/L 氯化鈉，1 mmol/L EDTA 和 2 mL/L Triton X-100），在冰浴條件下用 Ultra Turrax 高速勻漿 3 次（2000～24000 r/min，每次 10 s，間隔 20 s），然后于 4 ℃條件下磁力攪拌 60 min，22000 g 離心 20 min，上清液經(jīng)白色絲綢過濾，用提取緩沖液定容至50 mL，搖勻后即組織蛋白酶B和L提取液，用于組織蛋白酶B和L活力測(cè)定。

肌肉組織蛋白酶B和L潛在活力測(cè)定：取2.5 mL反應(yīng)液（組織蛋白酶B活力測(cè)定反應(yīng)液為：50 mmol/L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 6.0，含 312.5 μmol/L Z-Arg-Arg-AMc，4 mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT 和3.4 mL/L Brij；組織蛋白酶B+L活力測(cè)定反應(yīng)液為：50 mmol/L 磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 6.0，含312.5 μmol/L Z-phe-Aig-AMC，4 mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT 和 3.4 mL/L Brij），分別加入 0.5 mL 組織蛋白酶B和L提取液，于37 ℃培養(yǎng)20 min，反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入6 mL無水乙醇終止反應(yīng)。產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度用熒光分光光度計(jì)于激發(fā)波長(zhǎng)380 nm和發(fā)射波長(zhǎng)440 nm測(cè)定。同時(shí)，用 AMC取代 Z-Arg-Arg-AMC或Z-Phe-Arg-AMC配制的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液代替酶活力測(cè)定反應(yīng)液，按照上述反應(yīng)過程和測(cè)定方法制備AMC濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣品的酶活力。一個(gè)酶活力單位（U）定義為37 ℃條件下每分鐘產(chǎn)生1 nmol AMC所需要的組織蛋白酶B或B+L的數(shù)量，測(cè)定結(jié)果表示為每克無鹽無脂肪股二頭肌干物質(zhì)所含的組織蛋白酶B或B+L活力單位，即U/g。組織蛋白酶L活力由組織蛋白酶B+L活力減去組織蛋白酶B活力計(jì)算而得。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有樣品均做3次平行，采用方差分析，結(jié)果以Mean±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 宣威火腿加工過程肌肉蛋白質(zhì)降解分析

2.1.1 宣威火腿蛋白質(zhì)組的雙向電泳圖譜

本試驗(yàn)初始采用pH值3.0～10.0、24 cm非線性干膠條進(jìn)行初步判斷宣威火腿蛋白的分布情況，并利用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，得到宣威火腿蛋白雙向電泳圖譜。經(jīng)圖譜分析后確定宣威火腿蛋白大部分分布在pH值4.0～7.0之間，之后則以pH值4.0～7.0、24 cm的非線性干膠條對(duì)宣威火腿蛋白進(jìn)行分離。圖1～5分別為腌制前、腌制結(jié)束、風(fēng)干結(jié)束、成熟中期與成熟結(jié)束階段宣威火腿股二頭肌的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，由圖可見，電泳分離較充分，圖像清晰可辨，拖帶、條紋不明顯，能滿足進(jìn)一步分析的需要。腌制前、腌制結(jié)束、風(fēng)干結(jié)束、成熟中期與成熟結(jié)束這5個(gè)階段的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為 1533±26，1523±18，1402±15，1196±21與1018±29個(gè)。圖6表明了在加工過程中宣威火腿肌肉蛋白質(zhì)存在明顯的降解情況，其中成熟中期到成熟結(jié)束階段肌肉蛋白質(zhì)降解較為突出。

圖1 腌制前（24 h左右）宣威火腿雙向電泳圖譜（pH值4.0～7.0非線性固相pH梯度膠條）Fig.1 The two dimensional electrophoresis map of Xuanwei ham in the pickling before (pH value of 4.0～7.0, non-line IPG strip)

圖2 腌制結(jié)束（28 d）宣威火腿雙向電泳圖譜（pH值4.0～7.0非線性固相pH梯度膠條）Fig.2 The two dimensional electrophoresis map of the end of Xuanwei ham pickle (pH value of 4.0～7.0, non-line IPG strip)

圖3 風(fēng)干結(jié)束（126 d）宣威火腿雙向電泳圖譜（pH值4.0～7.0非線性固相pH梯度膠條）Fig.3 The two dimensional electrophoresis map of the end of the ham air-dried (pH value of 4.0～7.0, non-line IPG strip)

2.1.2 宣威火腿加工過程差異蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定

與腌制前對(duì)比，將成熟中期表達(dá)量降低的點(diǎn)編號(hào)為A組，升高的點(diǎn)編號(hào)為B組；將成熟結(jié)束表達(dá)量降低的點(diǎn)編號(hào)為C組，升高的點(diǎn)編號(hào)為D組。

經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析及Mascot引擎檢索，得到蛋白檢索結(jié)果。由表1可知成熟中期階段肌表達(dá)量下降主要肌鈣蛋白T亞基、肌球蛋白輕鏈等22種蛋白質(zhì)；相反地，12種肌動(dòng)蛋白及肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈以及肌球蛋白輕鏈在該階段表達(dá)量升高。而宣威火腿在成熟結(jié)束階段，除β-烯醇有降低情況并未檢測(cè)其他蛋白質(zhì)表達(dá)下降，血清白蛋白、ATP合成酶β亞基、肌球蛋白、α-晶狀體蛋白B鏈則表達(dá)升高蛋白質(zhì)。

圖4 成熟中期（248 d）宣威火腿雙向電泳圖譜（pH值4.0～7.0非線性固相pH梯度膠條）Fig.4 The two dimensional electrophoresis map of the middle of the ham mature (pH value of 4.0～7.0, non-line IPG strip)

圖5 成熟結(jié)束（365 d）宣威火腿雙向電泳圖譜（pH值4.0～7.0非線性固相pH梯度膠條）Fig.5 The two dimensional electrophoresis map of the end of the ham mature (pH value of 4.0～7.0, non-line IPG strip)

圖6 宣威火腿加工過程蛋白質(zhì)降解情況Fig.6 The degradation of muscle proteins during the processing of Xuanwei ham

表1 蛋白點(diǎn)檢索結(jié)果Table 1 The retrieve results of protein spots

2.2 宣威火腿加工過程組織蛋白酶活性分析

宣威火腿不同加工階段肌肉組織蛋白酶B和L的殘余潛在活力測(cè)定結(jié)果見圖7。組織蛋白酶B和L肌肉組織中重要的內(nèi)肽酶，在加工結(jié)束時(shí)仍然存在一定的活性，對(duì)蛋白質(zhì)降解和風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生有重要作用。其中由于組織蛋白酶B的影響，成熟中期肌球蛋白、原肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白均有下降，而肌鈣蛋白T亞基收組織蛋白酶L的影響表達(dá)量有所下降。由圖7可知，組織蛋白酶B的潛在活力在加工過程中逐漸下降，由腌制前的 12472.48 U/g下降到成熟結(jié)束的 2436.75 U/g，成熟中期下降速度較快，加工結(jié)束時(shí)殘余活力為腌制前的10.25%。組織蛋白酶L的潛在活力也在加工過程中逐漸下降，但在風(fēng)干結(jié)束時(shí)期有明顯升高的趨勢(shì)，之后則連續(xù)快速下降，加工結(jié)束時(shí)殘余活力為腌制前的8.56%。在火腿腌制結(jié)束前，組織蛋白酶L的活力比組織蛋白酶B低，而在風(fēng)干結(jié)束與成熟結(jié)束時(shí)兩個(gè)工藝點(diǎn)的其殘余活力也均高于組織蛋白酶B。

圖7 宣威火腿加工過程組織蛋白酶B和L的潛在活力變化Fig.7 Change of potential activity of cathepsin B and L during the processing of Xuanwei ham

3 討論

3.1 傳統(tǒng)干腌火腿中的蛋白質(zhì)變化會(huì)直接影響成品的品質(zhì)，而蛋白質(zhì)降解能夠產(chǎn)生肽類、氨基酸等小分子呈味物質(zhì)，還能作為火腿的風(fēng)味前體物產(chǎn)生特殊的腌臘肉制品風(fēng)味[13]。蛋白質(zhì)降解程度主要受到工藝過程中溫濕度條件和過程產(chǎn)品中鹽分、水分的影響。本研究腌制前、腌制結(jié)束、風(fēng)干結(jié)束、成熟中期與成熟結(jié)束這 5個(gè)階段的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為 1533±26、1523±18、1402±15、1196±21 與 1018±29 個(gè)，說明宣威火腿在加工過程中存在明顯的蛋白質(zhì)降解情況。國(guó)外學(xué)者[14,15]通過SDS-PAGE電泳方法對(duì)serrano火腿和Bayonne火腿進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)火腿的水溶性蛋白和肌原纖維蛋白的水解程度隨加工過程在加劇；Larrea等[16]同樣利用SDS-PAGE研究西班牙Teruel干腌火腿在加工過程中肌肉蛋白降解情況，結(jié)果表明Teruel干腌火腿在加工過程中水溶性蛋白質(zhì)在腌制和風(fēng)干階段降解明顯，肌原纖維蛋白在成熟階段降解更明顯，本研究結(jié)果均與之相似。

3.2 然而傳統(tǒng)的 SDS-PAGE電泳無法分析鑒定出分子量或等電點(diǎn)相同的蛋白質(zhì)，穆雪[17]成功建立了火腿

肌肉蛋白質(zhì)雙向電泳方法，同時(shí)對(duì)4個(gè)不同品牌的金華火腿樣品進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，分別得出了4種樣品雙向電泳凝膠技術(shù)的平均蛋白點(diǎn)數(shù)；Aldo Di Luccia等[18]通過采用雙向電泳研究干腌火腿成熟過程中肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的降解情況，證明了雙向電泳是研究肌肉蛋白酶敏感性及蛋白圖譜的有效方法，結(jié)果表明肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白與肌球蛋白輕鏈在火腿加工成熟過程中逐漸遞減消失，同時(shí)鑒定發(fā)現(xiàn)出一種新型肌動(dòng)蛋白；Théron等[19]通過雙向電泳分離Bayonne火腿股二頭肌與半膜肌中水不溶性蛋白，并以MALDI-TOF/TOF MS對(duì)分離的蛋白進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)部位之間存在73個(gè)蛋白或肽段有差異表達(dá)；本研究同樣利用MALDI- TOF/TOF MS鑒定出ATP合成酶β亞基，檢索分值為129分，且結(jié)果可信度較高。

3.3 在干腌火腿加工過程中，組織蛋白酶B和L是肉中重要的內(nèi)肽酶，對(duì)肌肉蛋白質(zhì)有廣泛的降解作用，組織蛋白酶在火腿從腌制到成熟整個(gè)加工過程都是有活性的，其活性會(huì)受到原料品種、原料肉品質(zhì)、加工工藝、腌制劑的組成等多種因素的影響，這些因素的任何變化都可能會(huì)導(dǎo)致火腿最終品質(zhì)的改變[20,21]。本研究中組織蛋白酶B和L在宣威火腿加工過程中均有一定活性，組織蛋白酶B的活性隨著加工過程的進(jìn)行而逐漸下降，而組織蛋白酶L的活性從腌制前到腌制結(jié)束時(shí)呈下降趨勢(shì)，到風(fēng)干結(jié)束時(shí)上升到最大隨后又開始下降。

3.4 分析原因可能是由于在火腿加工初期，微生物開始生長(zhǎng)，導(dǎo)致pH值下降，因此組織蛋白酶L活性升高，而隨后的風(fēng)干到成熟過程外界溫度逐漸升高，火腿的水分蒸發(fā)加劇，含鹽量也有所增加，因此組織蛋白酶的活性受到抑制，下降較為明顯。Parreno等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與其他蛋白酶相比，組織蛋白酶B的活性最為穩(wěn)定，本研究中的組織蛋白酶活力始終呈下降趨勢(shì)；還有學(xué)者[14,23]報(bào)道稱組織蛋白酶B和B+L在加工初始階段活性最強(qiáng)，而加工結(jié)束時(shí)的組織蛋白酶B、B+L等酶殘留活性是初始時(shí)的5%～10%，而本研究宣威火腿到加工結(jié)束時(shí)組織蛋白酶B、L殘余活力分別為腌制前的10.25%和8.56%。組織蛋白酶B+L的殘留活性是判斷西班牙干腌火腿質(zhì)構(gòu)缺陷的重要指標(biāo)，因此測(cè)定內(nèi)源蛋白酶活性對(duì)于預(yù)防和調(diào)控干腌火腿的品質(zhì)具有積極意義[24]。

4 結(jié)論

本研究利用雙向電泳技術(shù)對(duì)宣威火腿加工過程中蛋白質(zhì)降解情況進(jìn)行了系統(tǒng)研究，所得宣威火腿加工過程中肌肉蛋白質(zhì)存在明顯的降解情況，其中成熟中期到成熟結(jié)束階段蛋白降解較為突出，并利用MALDI-TOF/TOF MS鑒定這兩個(gè)加工階段分離出的差異蛋白共 39種，與此同時(shí)宣威火腿組織蛋白酶 B和L的潛在活力在加工過程中均逐漸下降。