席紅如，吳暉，賴富饒，馬娟娟，劉袆帆，陳文博

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

卡琪花蒂瑪（Kacip Fatimah）是一種生長在東南亞熱帶雨林中的常見紅色草藥，它的植物學名為Labisia pumila，是紫金?？乒嗄緺畲厣参?。純正的卡琪花蒂瑪僅生長于馬來西亞海拔350 m高的無污染熱帶雨林中[1]。

馬來西亞歷代的女人們都用它的葉子煮水喝，青年少女用它來調(diào)節(jié)月經(jīng)不規(guī)律，月經(jīng)疼痛；孕婦用它來促進生產(chǎn)；產(chǎn)婦用它來縮宮，恢復產(chǎn)后體力，治療產(chǎn)后骨質(zhì)疏松；更年期婦女用它來緩解雌激素缺乏帶來的相關疾?。ㄐ难芗膊?，骨質(zhì)疏松癥等）；還可用它來進行美容養(yǎng)顏、提升性欲等等[2]。

目前，卡琪花蒂瑪中已經(jīng)報道的活性成分包括黃酮類、多酚類、皂苷類和有機酸類等[3]。黃酮類化合物是卡琪花蒂瑪中一種重要的次級代謝產(chǎn)物。黃酮類物質(zhì)具有較強的清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射以及保護心血管系統(tǒng)等生物活性功能[4]。因此研究卡琪花蒂瑪中黃酮類化合物，對卡琪花蒂瑪中的黃酮的有效開發(fā)利用具有重要的意義。

周潔等[5]人的研究結果表明兒茶素通過抗氧化抑制相關酶活性及抑制信號傳導等來抑制腫瘤細胞入侵、細胞增殖、細胞血管再生及轉移，并誘導細胞凋亡。曾亮[6]等人的研究結果表明兒茶素會抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的對數(shù)生長期，增加細菌細胞膜的通透性，造成細菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)的滲漏，使細菌代謝發(fā)生紊亂，進而達到抑菌效果。甘寧[7]等人通過動物實驗研究，結果表明楊梅素通過降低ROS水平恢復內(nèi)源性 BMMSCs的成骨能力，減少卵巢大鼠骨量丟失。卞杰[8]等人的研究表明楊梅素通過激活Caspase家族蛋白實現(xiàn)對肝癌細胞HepG2細胞株的增殖抑制及誘導凋亡作用。

本實驗分別測定了卡琪花蒂瑪莖和葉中黃酮的含量及各種黃酮類化合物的組成成分，并對卡琪花蒂瑪莖和葉中的黃酮的自由基清除能力做了對比分析。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與試劑

卡琪花蒂瑪?shù)那o和葉片，產(chǎn)自馬來西亞，洗凈，晾干，粉碎，過40目篩，置于陰涼干燥處待用。

1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，阿拉丁公司；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（ABTS），申工公司；L-抗壞血酸（Vc），亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、過硫酸鉀（K2S2O8）、二水磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O）、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）、鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]）、三氯乙酸、三氯化鐵（FeCl3）等均為市售分析純。標準品：大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷、黃豆黃苷、葛根素、槲皮素、柚皮苷、楊梅素、兒茶素、蘆丁、芹菜素、山奈酚、白楊素、木犀草素、表兒茶素，阿拉丁公司。

1.2 儀器及設備

Spectrumlab 752S紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；6CE-60F-717P型高效液相色譜儀，美國Waters公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HHS-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海橫平儀器儀表廠；RE-52旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮系列化儀器廠；DLSB-5L/25型低溫冷卻液循環(huán)泵，鞏義市予華儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃酮含量標準工作曲線的繪制

準確稱取20 mg蘆丁標準品，用蒸餾水溶解完全后定容至100 mL容量瓶中，得到0.2 mg/mL蘆丁標準溶液；稱取5 g亞硝酸鈉于燒杯中，用蒸餾水溶解完全后定容到 100 mL容量瓶中得到 5%亞硝酸鈉溶液；稱取10 mg硝酸鋁于燒杯中，用蒸餾水溶解完全后定容到100 mL容量瓶中得到10%硝酸鋁溶液；稱取4 g氫氧化鈉于燒杯中，用蒸餾水溶解完全后定容到100 mL容量瓶中得到4%氫氧化鈉溶液。

用移液槍準確移取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5 mL 0.1 mg/mL 的蘆丁標準溶液于15 mL具塞試管中，然后再分別加入5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1、0 mL蒸餾水，得到濃度分別為0、20、40、60、80、100、120、160、200 mg/mL的蘆丁溶液；再向每個具塞試管中分別加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻后反應6 min；然后再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻后反應6 min；最后在加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻，避光反應15 min后在510 nm處測吸光值（每個梯度做3個平行）。

1.3.2 卡琪花蒂瑪中黃酮含量的測定

稱取一定量的已過 40目篩的卡琪花蒂瑪莖和葉片的粉末，在一定的溫度、乙醇濃度、料液比條件下提取一定時間，離心，過濾，定容[9]。移取一定量待測液按 1.2.1方法測定吸光度，按下式計算黃酮提取率：黃酮提取率(mg/gFW)=(C×V×n)/m

式中，C代表根據(jù)回歸方程計算得到的質(zhì)量濃度（mg/mL），V代表提取液總體積（mL），n代表稀釋倍數(shù)，m代表卡琪花蒂瑪葉片粉末質(zhì)量（g）。

1.3.3 HPLC法測定黃酮類化合物含量

參考文獻[3,10]的方法，但對洗脫程序，進樣量和流速條件稍作修改。A：0.1%甲酸；B：乙腈。洗脫程序：0～5 min：10%B；5～45 min 10%～90%B；45～50 min 90%B；50～55 min 90%～10%B；55～60 min 10%B；流速為0.6 mL/min，進樣量為20 μL。將10種黃酮和6種異黃酮類化合物的標準品配置成一定濃度的溶液，按上述色譜條件測定并制作標準曲線，采用外標法進行定量。每種黃酮類化合物的含量用μg/mL表示。

1.3.4 DPPH自由基清除能力測定

DPPH實驗方法參照文獻[11]方法進行改進。用乙醇配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH工作液，避光放置一個晚上待用。向1 mL不同濃度的樣品溶液中加入3 mL DPPH 工作液，暗處反應 30 min 后在 517 nm 處測定吸光值。以Vc作為陽性對照，清除DPPH自由基能力按下式計算：

DPPH自由基清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中，A0為1 mL 無水乙醇+3 mL DPPH 乙醇溶液的吸光度；A1為1 mL樣品溶液+3 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；A2為1 mL樣品溶液+3 mL乙醇溶液的吸光度。

1.3.5 ABTS自由基清除能力測定

ABTS實驗方法參照文獻[12]進行改進。首先分別配制濃度為 7.4 mmol/L的 ABTS溶液和濃度為 2.6 mmol/L的高硫酸鉀溶液，然后將二者按1:1混合，室溫下避光過夜。使用時用無水乙醇將ABTS工作液稀釋40～50倍左右，使其吸光值A734=0.7±0.02。然后向0.2 mL不同濃度的樣品溶液中加入 2 mL稀釋過的ABTS工作液，暗處反應30 min后在734 nm處測定吸光值。

1.3.6 Fe3+還原力測定

Fe3+還原實驗方法按照參考文獻[13]。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗均做 3組平行，結果以平均值±標準方差（mean±SD）表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析（one-way ANOVA）和 Duncan's multiple range test方法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(p＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 黃酮含量標準工作曲線

圖1 蘆丁標準工作曲線 Fig.1 Standard curve of Rutin

蘆丁的標準曲線回歸方程為Y=0.0084X-0.0709，其中Y為吸光度，X為蘆丁濃度μg/mL；R2=0.9922，表明在 20～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關系，可用于測定黃酮含量。根據(jù)最優(yōu)提取方法分別提取卡琪花蒂瑪莖和葉中的黃酮，并測得卡琪花蒂瑪?shù)那o和葉中黃酮含量分別為 27.52±4.21、35.43±14.16 mgRutin/gFW，即每克卡琪花蒂瑪莖和葉的粉末中黃酮的含量分別為 27.52±4.21、35.43±14.16 mg。

2.2 卡琪花蒂瑪中黃酮的含量

由表1可知，大豆苷和黃豆黃苷；木犀草素和槲皮素；芹菜素和染料木苷三組的出峰時間較為接近，其他 10種黃酮標準品在該條件下均可以得到較好的分離。

表2 莖和葉中黃酮的HPLC分析Table 2 HPLC analysis of Stem and Leaf

由表 2可知，莖中含有染料木苷（2.44±0.012 mg/gFW）、柚皮苷（2.45±0.027 mg/gFW）、和楊梅素（10.16±2.443 mg/gFW）；葉子中含有兒茶素（9.18±1.182 mg/gFW）、黃豆黃苷（2.55±0.031 mg/gFW）、蘆?。?.92±0.022 mg/gFW）、柚皮苷（2.50±0.017 mg/gFW ） 和 楊 梅 素 （ 10.18±2.347 mg/gFW）。其中莖中楊梅素的含量較高，葉子中含有的兒茶素和楊梅素含量較高；并且葉子中楊梅素的含量和莖中楊梅素的含量相近。莖中染料木苷和葉中的黃豆黃苷均是異黃酮，是植物雌激素，有雌二醇具有類似的功能，推測可能與卡琪花蒂瑪可以治療產(chǎn)后骨質(zhì)疏松，恢復產(chǎn)后體力等功能密切相關；而其他種類的黃酮如楊梅素，兒茶素等可能與卡琪花蒂瑪具有很好的抗氧化活性密切相關。

2.3 DPPH自由基清除能力

圖2 DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity

卡琪花蒂瑪中黃酮類物質(zhì)和Vc對DPPH清除能力見圖2。由圖2可知，DPPH自由基的清除能力與黃酮和Vc的濃度密切相關。隨著黃酮濃度的升高，對DPPH自由基的清除能力也增強。當葉子中黃酮濃度在3 μg/mL時，它對DPPH自由基的清除能力就達到最大；當莖中黃酮濃度在6 μg/mL時它對DPPH自由基的清除能力達到最大；葉子中黃酮對DPPH自由基清除能力的IC50為0.99 μg/mL，莖中黃酮對DPPH自由基清除能力的IC50為1.91 μg/mL；從圖中還可以看出當黃酮濃度在1.5～6 μg/mL時，對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的升高明顯增高，在 0.375～0.75 μg/mL和6～12 μg/mL時，隨濃度升高清除能力未出現(xiàn)明顯升高，分析可能是黃酮濃度過低時，不能夠與過量自由基中和，所以DPPH本身的顏色掩蓋了被中和的DPPH的顏色，因此不會呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性；而當黃酮濃度過高時，DPPH自由基幾乎完全被中和，所以也不會呈現(xiàn)出劑量依賴性。并且由圖可以看出卡琪花蒂瑪中莖和葉對 DPPH自由基的清除能力是Cleaf＞Cstem。

2.4 ABTS自由基清除能力

卡琪花蒂瑪中黃酮類物質(zhì)和Vc對ABTS清除能力見圖3。由圖3可知，ABTS自由基的清除能力與黃酮的濃度密切相關。當黃酮濃度在6 μg/mL時，它對ABTS自由基的清除能力就達到最大；葉子中黃酮對ABTS自由基清除能力的IC50為2.26 μg/mL，莖中黃酮對ABTS自由基清除能力的IC50為3.60 μg/mL；并且由圖可以看出在濃度范圍為0.375至6 μg/mL時，對ABTS的清除能力Cleaf＞Cstem＞Vc。當黃酮濃度過低，也即是抗氧化劑含量過低時，不能夠組織ABTS被氧化成綠色的 ABTS·+，當黃酮濃度適量時，隨著黃酮濃度的升高，被氧化的 ABTS·+自由基的量就會下降，當黃酮濃度過高時，就會阻止所有的ABTS被氧化，所以清除率就不會再隨著黃酮濃度升高而增大。

圖3 ABTS自由基清除能力Fig.3 ABTS radical scavenging activity

2.5 Fe3+還原能力

圖4 Fe3+還原能力Fig.4 Fe3+ Reducing power

卡琪花蒂瑪中黃酮類物質(zhì)和Vc對Fe3+還原能力見圖4。由圖4可知，F(xiàn)e3+還原能力與黃酮和Vc的濃度密切相關。當葉子中黃酮濃度在12 μg/mL時，它對Fe3+還原能力就達到最大；當莖中黃酮濃度在 12 μg/mL時它對Fe3+還原能力達到最大；并且由圖可以看出在濃度范圍為0.375至12 μg/mL時，對Fe3+還原能力Cleaf＞Cstem＞Vc。并且在1.5至12 μg/mL 時，黃酮對Fe3+的還原能力呈顯著相關性。

3 結論

3.1 卡琪花蒂瑪莖和葉子中的總黃酮含量分別為27.52±4.21、35.43±14.16 mgRutin/gFW。其中，莖中含有染料木苷（2.44±0.012 mg/gFW）、柚皮苷（2.45±0.027 mg/gFW）、和楊梅素（10.16±2.443 mg/gFW）；葉子中含有兒茶素（9.18±1.182 mg/gFW）、黃豆黃苷（2.55±0.031 mg/gFW）、蘆丁（2.92±0.022 mg/gFW）、柚皮苷（2.50±0.017 mg/gFW）和楊梅素（10.16±2.347 mg/gFW）。

3.2 莖和葉中的黃酮的抗氧化能力在不同的抗氧化體系中均有顯著效果：其中莖中黃酮對DPPH、ABTS自由基清除能力的 IC50值分別為 1.91、3.60 μgRutin/mL，葉子中黃酮對 DPPH、ABTS自由基清除能力相對較好，IC50值分別為 0.99、2.26 μgRutin/mL。

3.3 根據(jù)實驗結果可知卡琪花蒂瑪莖中黃酮含量約占2.8%，葉中黃酮含量約占3.5%，均高于葛根[14]中1.2%黃酮和具有類似功能的益母草[15]中0.28%黃酮；并且卡琪花蒂瑪葉中黃酮含量高于莖中黃酮含量?？ㄧ骰ǖ佻斨泻肯鄬^多的黃酮-兒茶素和楊梅素具有很好抗氧化、抗癌[5]和減少骨質(zhì)疏松[7]的作用與本實驗結果中卡琪花蒂瑪具有很好抗氧化活性相呼應，為進一步開發(fā)利用卡琪花蒂瑪中黃酮提供了理論基礎。