黃桂東，黃偉志，馮結(jié)鏵，唐素婷，吳子鎣，鐘先鋒

（佛山科學技術(shù)學院食品科學與工程學院，廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，佛山農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心，廣東佛山 528200）

冷凍面團技術(shù)應用在饅頭上，不僅能延長饅頭耐藏性能，而且較大程度的保持饅頭的原有風味、營養(yǎng)， 使得冷凍面團饅頭產(chǎn)業(yè)得到迅速發(fā)展。雖然低溫儲存方式延長了饅頭的貨架期，但對饅頭品質(zhì)也產(chǎn)生了一定負面作用[1,2]。Meziani等[3]研究證實凍藏過程中會造成酵母活菌數(shù)減少，導致饅頭品質(zhì)下降；也有相關(guān)報道指出凍藏過程中會給面團品質(zhì)帶來傷害，例如酵母活力降低、面筋結(jié)構(gòu)強度弱化和產(chǎn)品感官特性變差等[3,4]。從宏觀角度上呈現(xiàn)出凍藏后饅頭醒發(fā)時間延長、比容變小等問題[5,6]。

據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，在凍藏過程中，由自由水形成的冰晶及重結(jié)晶會較大程度地傷害酵母細胞，致使酵母細胞受到不可復原的機械損傷，酵母活性下降，甚至導致酵母細胞死亡；同時冰晶也會破壞面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使面團的結(jié)構(gòu)牢固性和持氣功能減弱，導致饅頭品質(zhì)下降[7,8]。因此冰晶是造成冷凍面團品質(zhì)下降的主要原因，目前國內(nèi)外尚無法較好地解決冷凍面團在凍藏過程中因冰晶導致的品質(zhì)下降問題。鑒此，為了解決冷凍面團饅頭品質(zhì)問題，探究其品質(zhì)劣變機理，石媛媛等[9]應用質(zhì)構(gòu)儀和核磁共振等技術(shù)，表明了凍藏時間的延長，冷凍面團的發(fā)酵力下降、饅頭的比容和質(zhì)構(gòu)特性呈現(xiàn)下降趨勢，冷凍面團失水率明顯升高，馳豫時間也隨凍藏時間的延長逐漸變大。姬成宇等[10]也通過傅里葉變換紅外光譜技術(shù)以及核磁共振技術(shù)等技術(shù)表明，隨著凍藏時間的延長，蛋白二級結(jié)構(gòu)中分子間β-折疊含量增大，β-轉(zhuǎn)角含量減小，而凍融循環(huán)使得α-螺旋結(jié)構(gòu)含量下降。

因此本文采用酵母菌活性測定、質(zhì)構(gòu)特性測定、傅里葉變換紅外光譜測定面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)、掃描電鏡觀察面團微觀結(jié)構(gòu)等方法進一步探討凍藏時間對冷凍面團饅頭品質(zhì)的影響，從宏觀和微觀角度，全面客觀地分析冷凍面團饅頭品質(zhì)變化，為后續(xù)提高冷凍面團饅頭品質(zhì)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金龍魚多用途麥芯粉，益海嘉里食品營銷有限公司；高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；白砂糖，佛山市昌大昌超級購物廣場有限公司；光譜純KBr，天津市科密歐化學試劑有限公司；氯化鈉、蛋白胨、葡萄糖、硫酸二氫鉀、瓊脂粉、硫酸鎂、孟加拉紅、氯霉素，廣州創(chuàng)天生物科技有限公司；蒸餾水、自來水。

1.2 儀器與設(shè)備

HMJ-01和面機，中山市雅樂思電器實業(yè)有限公司；LRHS-300F-II恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；DHG-9248A鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；GR60DA全自動滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；寧波新芝Seients-30N冷凍干燥機，廣州倍立思儀器有限公司；TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀，布魯克（北京）科技有限公司；日立高新S-4800掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；DW-40L188低溫冰箱，上海領(lǐng)德儀器有限公司；Thermo超低溫冰箱（-80 ℃），濟南博鑫生物技術(shù)有限公司；TXB622L電子精密天平，上海冠唯儀器有限公司；DF-4型紅外壓片機，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺，廣州市深華生物技術(shù)有限公司；DHP-9162型培養(yǎng)箱，上海晟析實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 冷凍面團饅頭的制作工藝要點

面團的基本配方（以面粉100%計算）：面粉100%，高活性干酵母1%，自來水50%，白砂糖10%。

根據(jù)參考文獻[11]方法進行操作并加以適當調(diào)整，其中在制作冷凍面團時的具體制作流程為：原輔料混合→和面→分切（稱重）→成型→速凍（-40 ℃，30 min）→冷藏（-20 ℃）。

將上述制得的冷凍面團分別凍藏 1周、2周、3周、4周、5周備用。

1.3.2 冷凍面團中酵母菌的測定

根據(jù)文獻[12]方法和結(jié)合實際情況進行改進測定面團酵母菌數(shù)。測定新鮮面團酵母菌數(shù)（以每克面團計算）：首先將新鮮面團用干凈剪刀或者刀從面團表面、內(nèi)芯共2不同部位剪切下5 g，置于45 mL無菌生理鹽水中搖動3 min左右以提取酵母菌；測定冷凍面團酵母菌數(shù)（以每克面團計算）：將凍藏的冷凍面團先在4 ℃低溫冰箱解凍至面團軟化后從表面、內(nèi)芯等不同部位剪切下5 g，置于45 mL無菌生理鹽水中搖動3 min左右以提取酵母菌。

用1 mL移液器吸取震蕩后上清液，以105倍數(shù)稀釋混勻后，吸取1 mL稀釋液加入到孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基中，進行涂布，涂布結(jié)束將培養(yǎng)皿倒置移放在37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后取出進行平板菌落計數(shù)。表面面團、內(nèi)芯面團各計數(shù)兩個平板，重復實驗3次，結(jié)果取平均值，冷凍后酵母菌存活率的計算公式為：

式中：P-冷凍后酵母菌的存活率，%；A：冷凍面團酵母菌落數(shù)（以每克面團計算），lg CFU/g；A0：新鮮面團酵母菌落數(shù)（以每克面團計算），lg CFU/g。

1.3.3 冷凍面團饅頭的質(zhì)構(gòu)測定

表1 質(zhì)構(gòu)儀程序參數(shù)Table 1 The Program Parameters of the Texture Instrument

根據(jù)文獻[13]方法，結(jié)合實際操作，將蒸制好的饅頭冷卻30 min后，使用TA.new plus物性測定儀進行質(zhì)構(gòu)測試，選取3個樣品重復試驗，每個樣品重復測3次，結(jié)果取均值。程序參數(shù)設(shè)定條件如表1。

1.4 冷凍面團面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的測定 1.4.1 面筋蛋白的提取

在馬丁法[14]基礎(chǔ)上，稍作改進。如下：將冷藏相應天數(shù)的冷凍面團放置于 4 ℃冰箱中解凍至面團軟化，備用；將解凍后的面團放在2% NaCl溶液中靜置15～20 min，接著對面團進行反復輕輕揉洗，盡可能確保面團完整性，一直揉洗至 NaCl溶液無混濁、無乳白色及面筋上無白色面粉顆粒，揉洗結(jié)束后將面筋蛋白至于40 ℃恒溫鼓風干燥箱中干燥，24 h。將干燥后面筋蛋白用研缽進行粉碎研磨，過100目篩，即得面筋蛋白，備用，同時將KBr用研缽研磨成粉末后，備用。

1.4.2 面筋蛋白的FT-IR測定

樣品混合前，先使用紅外干燥機對面筋蛋白及KBr干燥 20～30 min。干燥后，用精密天平稱量 2.0 mg面筋蛋白樣品及0.2～0.4 g KBr，混合，用瑪瑙研缽研磨均勻后，用紅外配套壓片機進行壓片，使壓片壓力保持在 15～20 kPa，1 min 后將樣品進行 FT-IR 掃描。背景采集使用 KBr固體作為空白，掃描范圍為400～4000 cm-1，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4[15]。

1.4.3 面筋蛋白FT-IR圖譜測定

實驗圖譜采用Omnic 8.2軟件及Perkfit 4.2軟件進行分析，對1600～1700 cm-1（酰胺Ⅰ帶）進行去卷積、平滑處理，求其二級導數(shù)獲得特征峰進行曲線擬合，擬合后得到特征峰峰面積，即可計算面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)含量[16,17]。酰胺Ⅰ帶特征峰與面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)對應關(guān)系為（表2）：

表2 酰胺Ⅰ帶特征頻率和峰的歸屬Table 2 Wavenumber and Band Assignment in Amide Ⅰ Region

1.5 冷凍面團微觀結(jié)構(gòu)的觀察

根據(jù)文獻[18]方法并結(jié)合實際條件，使用掃描電子顯微鏡觀察、記錄凍藏不同時間的冷凍面團微觀結(jié)構(gòu)。將凍藏后樣品切成1 cm2大小的正方形進行冷凍干燥，冷凍干燥結(jié)束后用導電雙面膠固定到樣品臺上進行樣品表面噴金，噴金后置于SEM下觀察（電壓10 kV）。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)采用 WPS Excel 2013 統(tǒng)計分析、SPSS 19.0、Omnic 8.2、Peakfit 4.2 軟件分析及 Origin 9.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍藏時間對冷凍面團中酵母菌的影響

由圖1、2可知，隨著凍藏時間延長，酵母菌數(shù)量及存活率呈遞減趨勢。實驗結(jié)果與陳迪等[19]研究冷藏時間延長與冷凍酸面團中乳酸菌活力顯著下降結(jié)論相一致。在新鮮面團中，表面酵母菌數(shù)量為 11.9 lg CFU/g，內(nèi)芯酵母菌數(shù)量為11.7 lg CFU/g；凍藏1周后，面團表面中酵母菌數(shù)量為6.1 lg CFU/g，內(nèi)芯酵母菌數(shù)量為5.9 lg CFU/g；由以上數(shù)據(jù)可知，酵母菌經(jīng)過凍藏后數(shù)量減少50%左右，這也客觀、真實地驗證了凍藏會對酵母菌造成損傷的這個理論。同時從圖1、2中還可得出，冷凍面團中表面酵母菌數(shù)量及存活率要比內(nèi)芯酵母菌數(shù)量及存活率要多。

圖1 不同凍藏時間對新鮮、冷凍面團酵母菌數(shù)的影響Table 1 Effects of Different Refrigeration Time on the Number of Yeast in Fresh and Frozen Dough

圖2 不同凍藏時間對冷凍面團酵母菌存活率的影響Table 2 Effect of Different Refrigerated Time on the Survival Rate of Yeast in Frozen Dough

這可能是在凍藏過程中面團中可凍結(jié)水分發(fā)生遷移，面團表面水分含量比內(nèi)芯水分要少，因此表面形成冰晶較內(nèi)芯少，從而冰晶對面團表面酵母菌傷害力相對較少，表面酵母菌數(shù)量比內(nèi)芯酵母菌數(shù)量高[20]。

2.2 凍藏時間對冷凍面團饅頭中質(zhì)構(gòu)的影響

圖3 不同凍藏時間對冷凍面團饅頭質(zhì)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of Different Refrigerated Time on Texture of Frozen Dough Steamed Bread

從圖3中可以看出，冷凍面團饅頭凍藏1周后，硬度、咀嚼性、膠著性分別為 2014 gf、1826.8 gf、1903.58 gf。

凍藏5周后硬度、咀嚼性、膠著性分別為3520 gf、3209.96 gf、3332.36 gf。由此可知，經(jīng)過 5 周凍藏，冷凍面團饅頭的硬度、咀嚼性、膠著性分別增大74.6%、75.7%、75.6%，這說明了凍藏時間對冷凍面團饅頭品質(zhì)是有影響的。根據(jù)相關(guān)研究表明，在凍藏期間，溫度的波動及水分遷移會造成冰晶重結(jié)晶，重結(jié)晶成大冰晶能使酵母細胞和面筋網(wǎng)絡(luò)受到機械損傷，一方面導致醒發(fā)階段酵母由于存活率低，產(chǎn)氣能力下降，蒸制后饅頭硬度變大；另一方面長時間凍藏對面筋網(wǎng)絡(luò)也造成不可逆的破壞，不能較好地支撐整個面團，使面團變得扁平、下塌，致使饅頭品質(zhì)下降[21]。

2.3 凍藏時間對冷凍面團中面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圖4 不同凍藏時間的冷凍面團面筋蛋白酰胺Ⅰ帶去卷積示意圖Fig.4 Schematic Diagram of Deconvolution of Frozen Dough Gluten Protein Bands at Different Refrigerating Time

由表3可知，冷凍面團峰屬都位于3300 cm-1左右，與3401 cm-1（蛋白質(zhì)或氨基酸中N-H鍵的伸縮振動區(qū)，當N-H鍵與O-H締合后，將向低波數(shù)位移）相比較，冷凍面團特征峰均向低波數(shù)位移，說明冷凍面團中有N-H鍵與氫鍵締合。同時從表中可看出，冷凍面團在酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中均有特征峰屬，表明冷凍面團含有淀粉、蛋白質(zhì)特性[22]，其中在酰胺Ⅰ中，冷凍面團的特征峰發(fā)生了較為明顯地偏移，說明凍藏時間的延長可能造成了面筋蛋白結(jié)構(gòu)改變[23]。在990～1450 cm-1波段中，只有 1024 cm-1處發(fā)生明顯偏移，說明凍藏時間的延長會使冷凍面團中的氫鍵（淀粉與面筋結(jié)構(gòu)蛋白分子之間的締結(jié)鍵）發(fā)生改變，這可能是由于凍藏時間的延長，冰晶的形成及冰晶重結(jié)晶影響了淀粉與面筋蛋白的結(jié)合，特征基團含量發(fā)生改變，最終導致特征峰吸收強度的改變[23～26]。

表3 FT-IR特征峰以及樣品吸收波數(shù)Table 3 FT-IR Characteristic Peaks and Absorption Wavenumbers of Dough with Different Amounts of Added Water

由圖4、表1峰歸屬分析可知，冷凍面團峰位置波數(shù)集中在1618±3（β-折疊）、1637±3（β-折疊）、1653±3（α-螺旋）、1663±4（β-轉(zhuǎn)角）、1683±2（β-轉(zhuǎn)角）這 5個區(qū)域內(nèi)，且只有在這5個區(qū)域有其特征譜帶，說明冷凍面團只包含α-螺旋、β-折疊及β-轉(zhuǎn)角這3種結(jié)構(gòu)，不存在無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。從表4中可知，隨著凍藏時間增加，冷凍面團面筋蛋白中α-螺旋都呈下降趨勢，β-轉(zhuǎn)角和β-折疊比例則呈上升趨勢。這與宋國勝等[28]研究得出的凍藏面筋蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)含量呈下降趨勢結(jié)論相一致。這可能是在凍藏過程，冰晶的形成及長大破壞面筋結(jié)構(gòu)中的氫鍵，降低面筋結(jié)構(gòu)致密性，蛋白分子發(fā)生構(gòu)象重排，從而導致α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少。

表4 凍藏期間面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化Table 4 Changes in the secondary Structure of the Gluten Protein during Refrigerated Time

2.4 凍藏時間對冷凍面團微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖5 不同凍藏時間對冷凍面團微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of Different Refrigeration Time on the Microstructure of Frozen Dough

圖5為冷凍面團樣品的掃描電鏡結(jié)果，從圖中可以清楚的看出，圖中圓球狀的是淀粉顆粒，淀粉顆粒被面筋蛋白包裹在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)；黑色孔洞可能是冰晶在冷凍干燥過程中升華留下的空間或者面團發(fā)酵產(chǎn)生CO2形成的氣孔所致。由圖a、c、e、g、i和b、d、f、h、j可知，隨著凍藏時間的增加，面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐步減少，淀粉顆粒與面筋結(jié)構(gòu)分離出來，部分淀粉顆粒完全裸露在外面，尤其在凍藏5周后與第1周對比可知，凍藏時間的延長會造成面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞，面筋結(jié)構(gòu)表面變的粗糙而且松散，導致更多的淀粉顆粒向外裸露出來，這結(jié)果也與王金水、Baier-Schenk等[33,34]的研究結(jié)論相一致。柳小軍[35]認為在凍藏延長過程中，冷凍面團中的冰晶不斷長大，破壞了面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時凍藏溫度的波動也會使一部分冰晶解凍成水分，并發(fā)生遷移至新的位置重新結(jié)晶，進一步加劇了對面筋蛋白結(jié)構(gòu)的破壞。

3 結(jié)論

本文從宏觀和微觀角度，探討了凍藏時間對冷凍面團饅頭品質(zhì)變化的影響。結(jié)果表明，隨著凍藏時間的延長，冷凍面團中的酵母菌數(shù)量及存活率呈遞減趨勢，其中凍藏1周后，表面和內(nèi)芯的酵母菌數(shù)量均減少5.8 lg CFU/g；經(jīng)過5周凍藏后，冷凍面團饅頭的硬度、咀嚼性、膠著性分別增大74.6%、75.7%、75.6%；面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋也隨著凍藏時間的延長呈下降趨勢，蛋白二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性逐漸下降；經(jīng)過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐步減少，淀粉顆粒與面筋結(jié)構(gòu)分離，部分淀粉顆粒完全裸露，說明過長的凍藏時間對冷凍面團饅頭品質(zhì)不利。本研究結(jié)果為后續(xù)研究改善冷凍面團饅頭品質(zhì)提供了理論依據(jù)。