宋家樂，陳聰，黃柳燕，曾榛,3，高揚(yáng)，吳華

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林 541100）（2.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210009）（3.廣西高校預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541100）（4.揚(yáng)州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇揚(yáng)州 225001）

腸黏膜屏障是由腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)所構(gòu)成的機(jī)械屏障，腸黏膜組織分泌的黏液和消化液所構(gòu)成的化學(xué)屏障，由腸道固有微生物菌落所構(gòu)成的生物屏障及主要腸道組織中免疫系統(tǒng)與其所分泌的免疫物質(zhì)構(gòu)成的免疫屏障等所構(gòu)成的具有維持腸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定功能，阻隔外源性有害物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的生物結(jié)構(gòu)[1]。腸黏膜屏障功能的異常是導(dǎo)致炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，腸應(yīng)激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)及腸道腫瘤發(fā)生的重要原因[2]。腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接所構(gòu)成腸上皮結(jié)構(gòu)在防止病原微生物入侵，細(xì)菌移位等方面具有重大意義[3]。臨床IBD患者腸上皮組織中的細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)遭受破壞，上皮細(xì)胞通透性增大，腸黏膜屏障損毀嚴(yán)重[4]。因此，改善腸上皮功能，維持細(xì)胞間緊密結(jié)構(gòu)完整則有助于改善IBD的臨床癥狀[5]。

柚子(Citrus maximaMerr.)是我國(guó)廣大南方地區(qū)栽培面積和產(chǎn)量較高的經(jīng)濟(jì)水果之一，屬蕓香科柑橘屬作物。研究發(fā)現(xiàn)，作為加工副產(chǎn)物的柚葉中含有豐富的多酚與黃酮類物質(zhì)[6,7]，是一種具有較好開發(fā)利用度的農(nóng)業(yè)資源廢棄物。近年來，多酚和黃酮類植物活性成分因其具抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能而越來越成為可持續(xù)性農(nóng)業(yè)和生物綜合利用研究和開發(fā)利用的重點(diǎn)[8]。

目前，柚葉總多酚提取物對(duì)于腸道上皮細(xì)胞高通透性保護(hù)作用的研究鮮見報(bào)道。人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞是一株具有與正常小腸上皮細(xì)胞類似的緊密連接、微絨毛等結(jié)構(gòu)而被公認(rèn)用于腸道屏障損傷與修復(fù)機(jī)制研究的經(jīng)典細(xì)胞系[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過利用LPS處理Caco-2腸上皮細(xì)胞制備細(xì)胞高通透性模型，研究柚葉總多酚對(duì)細(xì)胞高通透性的保護(hù)效果并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶-EDTA 消化液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，美國(guó) Thermo Scientific公司；Trizol試劑、OligodT18、RNase、dNTP、MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，美國(guó)Invitrogen公司；ROX reference Dye和SYBR Premix Ex Taq II，日本 TAKARA 公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐(FD40，分子量 40000 u)、大腸桿菌脂多糖(LPS)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒，南京建成生物工程研究所；IL-1β、IL-8、TNF-α試劑盒，美國(guó)Cloud colon公司。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。新鮮柚葉采自廣西壯族自治區(qū)平樂縣龍窩果園，并經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定。

1.2 儀器與設(shè)備

EYELA N-1001S真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會(huì)社；GR300型超聲波清洗機(jī)，山東國(guó)銳超聲機(jī)械有限公司；Biotek Elx808酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；ND2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀、3110型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó) Thermo Scientific公司；AL204電子分析天平，梅特勒-托利多公司上海有限公司；電熱恒溫水浴鍋 HWS-28，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀，德國(guó)BMG公司；MERS00002 Millicell-ERS上皮跨膜細(xì)胞電阻儀，美國(guó)Millipore公司。

1.3 柚葉總多酚提取物的制備

新鮮柚葉雙蒸水沖洗除雜后，真空冷凍干燥。凍干柚葉經(jīng)粉碎后過60目篩備用。取柚葉粉(10 g)加入250 mL乙醇(60%，V/V)后在63 ℃條件下超聲提取28 min(超聲功率245 W)[6]。濾液經(jīng)3000 r/min離心15 min后棄渣收集上清，50 ℃真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，制成柚葉總多酚提取物(收率為30.54%)，-80 ℃儲(chǔ)存待用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

Caco-2人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系(源自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心)由桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院鄒先瓊教授饋贈(zèng)。細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS與1%青-鏈霉素雙抗液)置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下濕化培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至80%時(shí)，胰蛋白酶-EDTA液按比例消化傳代，取指數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

以DMEM 培養(yǎng)液(含LPS：2 μg/mL)處理細(xì)胞24 h制備細(xì)胞模型。模型細(xì)胞以柚葉總多酚提取物(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。正常組為未經(jīng)過任何處理的正常Caco-2細(xì)胞。

1.5 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率及LDH脫氫酶水平

細(xì)胞按前述分組處理后，移除內(nèi)培養(yǎng)基(用于后續(xù)LDH酶活性測(cè)定)并加入100 μL的MTT試劑(終質(zhì)量濃度：0.5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，每孔加入 DMSO (100 μL)避光振蕩 30 min，測(cè)定OD490 nm后按公式：細(xì)胞生存率(%)＝OD樣品組/OD正常組×100來計(jì)算細(xì)胞生存率。LDH脫氫酶水平采用比色試劑盒按照說明書操作要求進(jìn)行測(cè)定。

1.6 模型細(xì)胞中細(xì)胞因子 IL-1β、IL-8、TNF-α分泌水平的測(cè)定

細(xì)胞接種到培養(yǎng)板并依前述方法處理后，4 ℃下收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。取適量培養(yǎng)上清液按照IL-1β、IL-8、TNF-α測(cè)定試劑盒說明書步驟操作(單位以pg/mL表示)。

1.7 模型細(xì)胞的膜通透性水平測(cè)定

依前述處理后的細(xì)胞接種至Transwell小室中，實(shí)驗(yàn)前測(cè)定跨上皮細(xì)胞電阻(trans epithelial electrical resistance，TEER)檢查細(xì)胞融合狀態(tài)和腸上皮屏障的完整性，取細(xì)胞屏障完整的細(xì)胞(TEER≥100 Ω.cm2)用于實(shí)驗(yàn)。移除Transwell小室內(nèi)外的培養(yǎng)液，HBSS液(pH 7.4)沖洗細(xì)胞 3 次，37 ℃孵育30 min 后測(cè)量TEER值，待TEER值穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。此外，在Transwell小室頂端腔內(nèi)加入100 μL的HBSS液(含有終濃度為1 mg/mL的FD-40)，37 ℃孵育2 h，收集側(cè)腔內(nèi)溶液，使用FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng) 480 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 530 nm)。

1.8 qRT-PCR 法測(cè)定細(xì)胞中 IL-1β、IL-8、TNF-α、occludin、claudin-1、ZO-1 和 MLCK的mRNA表達(dá)

Trizol試劑盒法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，紫外分光檢測(cè)提純后的RNA濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取總RNA(2 μg)加入 dNTPs(1 μL)、OligodT18引物(1 μL)、MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(1 μL)、RNases抑制劑(1 μL)及5×Buffer (10 μL)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取適量cDNA (2 μL)用qRT-PCR法檢測(cè)occludin、claudin-1、ZO-1和MLCK的表達(dá)量。在總反應(yīng)體系中(20 μL)加入上游和下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq II (10 μL)、50×ROX reference Dye (0.4 μL)和滅菌雙蒸水(5.6 μL)，充分混勻后置于 Quant Studio TM 6 Flex PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為 95 ℃ 30 s，95 ℃ 25 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s，共 40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 5 min。每個(gè)基因cDNA樣本平行擴(kuò)增3次，取Ct值均數(shù)，依公式計(jì)算目的基因表達(dá)量[F=2(檢測(cè)樣品中基因的Cr值-檢測(cè)樣品中持家基因的Cr值)/2(空白樣品中基因的Cr值-空白樣品中持家基因的Cr值)]。

各引物序列如下：IL-1β(上游：5’-GAATGACGCCCTCAATCAAAGT-3’， 下 游 ：5’-TCATCTTGGGCAGTCACATACA-3’)，IL-8 (上游：5’-CCTGAACCTTCCAAAGATGGC-3’， 下 游 ：5’-TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3’)， TNF-α(上游 ： 5’-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3’， 下 游 ：5’-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3’)，Occludin(上游：5’-CTTCCAATGGCAAAGTGAATGAATGA-3’， 下游：5’-TACCACCGCTGCTGTAACGAG-3’)，claudin-1 (上游：5’-CCAGGTACGAATTTGGTCAGG-3’，下游：5’-TGGTGTTGGGTAAGAGGTTGT-3’)，ZO-1(上游：5’-GAGCCTAATCTGACCTATGAACC-3’， 下 游 ：5’-TGAGGACTCGTATCTGTATGTGG-3’)，MLCK(上游：5’-CAACAGGGTCACCAACCAGC-3’，下游：5’-GCCTTGCAGGTGTACTTGGC-3’)，GAPDH(上游：5’-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3’， 下 游 ：5’-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3’)。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本研究中，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3次，結(jié)果以均值(means)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析與統(tǒng)計(jì)處理，p＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 柚葉總多酚提取物對(duì)LPS所致Caco-2細(xì)胞生存率和細(xì)胞LDH釋放水平的影響

如表1示，Caco-2細(xì)胞在經(jīng)LPS(2 μg/mL)處理后細(xì)胞的生存率較正常組細(xì)胞相比下降至43.44%。給予不同濃度的柚葉總多酚提取物處理后，受損細(xì)胞的生存率顯著升高。

隨著柚葉總多酚提取物作用濃度的增加，受損細(xì)胞的生存率逐漸升高并呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系(p＜0.05)。特別是在經(jīng)加高濃度(100 μg/mL 和 150 μg/mL)的柚葉總多酚提取物處理后，模式細(xì)胞的生存率分別升高至80.6%和86.1%，生存率分別較未經(jīng)處理的模型細(xì)胞生存率增高1.86倍和1.98倍。

LDH是一種在正常生理情況下穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)部的功能酶。當(dāng)細(xì)胞遭受外界強(qiáng)烈的應(yīng)激刺激導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷后，LDH能夠直接從細(xì)胞內(nèi)部溢出。因此，LDH被常用于作為一種有效的生物指標(biāo)來評(píng)估細(xì)胞損傷發(fā)生程度[10]。與正常組細(xì)胞相比，LPS模型組細(xì)胞中LDH的溢出量為正常組細(xì)胞的4.27倍。經(jīng)柚葉總多酚提取物處理模型細(xì)胞后，細(xì)胞 LDH的外溢水平顯著降低，且抑制效果存在顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系(p＜0.05)。較高濃度的柚葉總多酚提取物(100 μg/mL和150 μg/mL)處理后的細(xì)胞中LDH溢出水平分別較未經(jīng)處理的模型細(xì)胞 LDH溢出水平降低 39.2%和42.9%。

表1 柚葉總多酚提取物對(duì)LPS所致Caco-2細(xì)胞生存率和細(xì)胞LDH釋放水平的影響Table 1 Effects of PLTPE on cell viability and LDH levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

2.2 柚葉總多酚提取物對(duì)LPS處理Caco-2細(xì)胞中IL-1β、IL-8、TNF-α分泌水平的影響

LPS(2 μg/mL)刺激可顯著增加 Caco-2細(xì)胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌(圖1)。不同濃度的柚葉總多酚提取物干預(yù)模式細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi) IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌水平均得到顯著抑制。

圖1 柚葉總多酚提取物對(duì)LPS處理Caco-2細(xì)胞中IL-1β(a)、IL-8(b)、TNF-α(c)分泌水平的影響Fig.1 Effects of PLTPE on IL-1β(a), IL-8(b) and TNF-α(c)levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

高濃度的柚葉總多酚提取物(100 μg/mL和 150 μg/mL)能夠使細(xì)胞中的IL-1β水平分別較LPS模型細(xì)胞中IL-1β水平降低15.15%和19.3%，IL-8分泌水平降低23.0%和34.8%。而在TNF-α分泌水平方面，柚葉總多酚提取物(100 μg/mL 和 150 μg/mL)能夠使TNF-α水平分別較LPS模型細(xì)胞中TNF-α水平降低31.9%和 36.9%。臨床方面的研究提示，異常表達(dá)的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎細(xì)胞因子是導(dǎo)致腸組織細(xì)胞間緊密連接丟失以及細(xì)胞上皮屏障損傷的主要原因，同時(shí)也在潰瘍性結(jié)腸(ulcerative colitis)和克羅恩病(Crohn’s disease)的發(fā)病過程中起著重要的作用[11～15]。而本研究結(jié)果提示，柚葉總多酚對(duì)LPS所誘發(fā) 的Caco-2腸上皮細(xì)胞炎癥模型具有較好的抗炎效果。

2.3 柚葉總多酚提取物對(duì)LPS處理Caco-2細(xì)胞中IL-1β、IL-8與TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

如圖 2所示，LPS(2 μg/mL)處理能夠顯著刺激Caco-2細(xì)胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄。不同濃度的柚葉總多酚提取物處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均得到顯著抑制。較未經(jīng)過柚葉總多酚提取物處理的LPS模型組細(xì)胞而言，高濃度的柚葉總多酚提取物(100 μg/mL和150 μg/mL)能夠分別有效降低LPS模型細(xì)胞中IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平至16.8%和21.1%，IL-8轉(zhuǎn)錄水平至27.0%和35.6%。同時(shí)，柚葉總多酚提取物還能顯著抑制LPS模型細(xì)胞中TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平至26.5%和34.8%。抑制IL-1β、IL-8和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的過度表達(dá)，不僅能夠降低腸道組織的炎性水平，還能減緩高炎癥環(huán)境所導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞間細(xì)胞緊密連接丟失的發(fā)生[1,12,13]。

2.4 柚葉總多酚提取物對(duì)LPS處理Caco-2細(xì)胞的膜通透性影響

圖3 柚葉總多酚提取物對(duì)LPS處理Caco-2細(xì)胞TEER(a)與FD-40(b)透過水平的影響Fig.3 Effects of PLTPE on TEER(a) and FD-40(b) flux levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

細(xì)胞膜通透性的改變程度能夠反映細(xì)胞間緊密連接和細(xì)胞單層屏障功能。如圖3a所示，LPS處理顯著造成Caco-2細(xì)胞中跨上皮細(xì)胞電阻(TEER)值的降低。而TEER值是用于檢測(cè)腸上皮細(xì)胞單層屏障功能變化的經(jīng)典生物指標(biāo)之一[16]，其主要反映腸上皮屏障模型的離子通透性改變情況[17]。給予不同濃度柚葉總多酚處理后，模型細(xì)胞的TEER值均顯著回升(p＜0.05)。其中，柚葉總多酚(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和150 μg/mL)處理組細(xì)胞分別較LPS組細(xì)胞的TEER值升高1.27倍、1.84倍、2.10倍和2.50倍。另一方面，異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐(FD40)透過度也屬于評(píng)估腸上皮細(xì)胞單層屏障功能變化的常用生物指標(biāo)[16]，其主要反映腸屏障細(xì)胞模型透過大分子物質(zhì)的能力，F(xiàn)D-40數(shù)值越高則意味著腸上皮屏障模型細(xì)胞通透性越高[18]。如圖3b所示，LPS處理顯著造成Caco-2細(xì)胞的通透性增高。經(jīng)柚葉總多酚處理后，模型細(xì)胞的 FD-40透過水平均呈顯著下降趨勢(shì)(p＜0.05)。柚葉總多酚(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 150 μg/mL)處理組細(xì)胞分別較LPS組細(xì)胞的FD-40透過水平降低8.06%、18.22%、24.86%和28.91%。以上結(jié)果提示，柚葉總多酚提取物可以顯著改善LPS所導(dǎo)致的Caco-2細(xì)胞高通透性情況的發(fā)生。

2.5 柚葉總多酚提取物對(duì)LPS處理Caco-2細(xì)胞中 Occludin、claudin-1、ZO-1和 MLCK 的mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響

圖4 柚葉總多酚提取物對(duì)LPS處理Caco-2細(xì)胞中細(xì)胞間緊密連接相關(guān)因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.4 Effects of PLTPE on tight junction related factors mRNA expression in LPS treated intestinal Caco-2 cells

腸上皮屏障是由相鄰腸上皮細(xì)胞間緊密連接所形成的環(huán)帶狀蛋白復(fù)合體，其主要的生理功能在于調(diào)控物質(zhì)從細(xì)胞旁途徑跨上皮運(yùn)輸，細(xì)胞間的構(gòu)造穩(wěn)定及細(xì)胞間的通訊等功能[19]。經(jīng)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，LPS處理造成Caco-2細(xì)胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(圖4)。Occludin、claudin-1與ZO-1蛋白都是構(gòu)成緊密連接(tight junction，TJs)的重要結(jié)構(gòu)蛋白[20]。

與正常組相比，LPS組細(xì)胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別下降62.56%，53.63%和58.62%。相反，給予柚葉總多酚處理后，模型細(xì)胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著回升。高濃度柚葉總多酚提取物(100 μg/mL和150 μg/mL)能夠較LPS模型分別提升Occludin(1.57倍與1.78倍)、claudin-1(1.56倍與1.73倍)和ZO-1(1.73倍與2.02倍)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)屬一類鈣調(diào)素激酶，自身被激活后能夠通過促肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化使其參與肌動(dòng)蛋白收縮，引發(fā)細(xì)胞骨架重排，破壞細(xì)胞TJ結(jié)構(gòu)，最終造成細(xì)胞間隙的開放，使得細(xì)胞間通透性增高[21]。如圖4示，LPS處理較正常組而言能顯著造成 Caco-2細(xì)胞中 MLCK的轉(zhuǎn)錄水平升高(p＜0.05)。柚葉總多酚處理后，模型細(xì)胞中MLCK的轉(zhuǎn)錄水平得到抑制。與 LPS組相比，最高濃度(150 μg/mL)的柚葉總多酚可顯著抑制MLCK的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(抑制率為31.30%)。抑制腸上皮細(xì)胞中MLCK的過度活化，對(duì)于維持腸上皮細(xì)胞屏障和細(xì)胞間緊密連接的重要作用[22]。

3 結(jié)論

本研究利用LPS構(gòu)建Caco-2腸上皮細(xì)胞高通透性細(xì)胞模型研究柚葉總多酚提取物對(duì)細(xì)胞高通透性的改善效果。結(jié)果提示，柚葉總多酚能夠有效抑制LPS造成的細(xì)胞損傷后 LDH外溢，提升細(xì)胞生存率。同時(shí)，柚葉總多酚可有效抑制 LPS誘發(fā)的 IL-1β、IL-8和TNF-α炎性細(xì)胞因子分泌并抑制其mRNA轉(zhuǎn)錄。此外，柚葉總多酚處理還能改善模型細(xì)胞的高通透性發(fā)生情況。在分子層面，柚葉總多酚能顯著上調(diào)受損細(xì)胞中 TJ相關(guān)因子(Occludin、claudin-1和 ZO-1)的mRNA轉(zhuǎn)錄，抑制導(dǎo)致細(xì)胞 TJ丟失的 MLCK的mRNA高轉(zhuǎn)錄。綜上述，柚葉總多酚對(duì) LPS所致Caco-2細(xì)胞發(fā)生高通透性的保護(hù)作用可能與其具有較強(qiáng)的抗炎作用以及對(duì)細(xì)胞TJ相關(guān)因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控能力有關(guān)。在后續(xù)研究中，課題組將重點(diǎn)針對(duì)柚葉總多酚是否具有MLCK活化過程中的上、下游信號(hào)通路的調(diào)控作用而展開深入研究。