胡 姍，方 乾，李 浩，朱海鯨，胡建宏*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.榆林學(xué)院 陜西省絨山羊工程技術(shù)研究中心，陜西 榆林719000 )

骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)與GDF9互為同系物，也稱為GDF9B，屬于BMPs大亞群，是TGFβ超家族中成員。BMP15 cDNA全長(zhǎng)約為1 180 bp，編碼的前體蛋白有400個(gè)氨基酸左右[1-2]。人和綿羊的BMP15成熟肽由125 個(gè)氨基酸殘基組成，含有 6個(gè)保守的Cys殘基，缺乏第4個(gè)Cys殘基。BMP15可以與 GDF9以非共價(jià)鍵連接成異源二聚體來(lái)發(fā)揮生物學(xué)活性。

BMP15在卵母細(xì)胞中可以大量表達(dá)，可以調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞增殖、和卵丘分化等，對(duì)雌性動(dòng)物的繁殖力有至關(guān)重要的調(diào)控作用[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，BMP15在卵泡發(fā)育中的作用有物種差異性，如在小鼠卵巢中，BMP15基因突變?yōu)殡s合和純合時(shí)，與野生型相比，可發(fā)育成胚胎的卵泡占所有卵泡的比重分別降低了約30%和43%，部分卵泡可以發(fā)育[6]。而綿羊BMP15基因突變?yōu)榧兒象w時(shí)卵泡發(fā)育停滯[7]。

有研究發(fā)現(xiàn)在一些物種的垂體、下丘腦、睪丸及其他組織中發(fā)現(xiàn)有BMP15表達(dá)[8-10]，這說(shuō)明BMP15也可能參與調(diào)節(jié)其他組織的發(fā)育。Otsuka等[8,11]研究發(fā)現(xiàn)，BMP15在小鼠垂體中表達(dá)，其可以調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸的內(nèi)分泌通路，促進(jìn)垂體分泌合成FSH，進(jìn)而促進(jìn)卵泡的發(fā)育。目前，除了卵巢和垂體外，關(guān)于BMP15在其他組織中的功能作用研究鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于BMP15的重要作用，本研究通過(guò)運(yùn)用生物信息學(xué)方法，應(yīng)用BioXM、DNAMAN、SignalP、ProtScale、PredicProtein等生物軟件或在線程序分析山羊BMP15基因cDNA序列信息，預(yù)測(cè)其編碼的蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性、信號(hào)肽、功能結(jié)構(gòu)域和功能，為進(jìn)一步研究對(duì)BMP15蛋白的功能調(diào)節(jié)機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得各物種的BMP15基因cDNA序列及其編碼的蛋白序列。各物種BMP15 GenBank 登錄號(hào)分別為：山羊NM_001285588.1、綿羊NM_001114767.1、小鼠NM_009757.5、大鼠NM_021670.1、豬NM_001005155.2、人 NM_005448.2、牛NM_001031752.1、斑馬魚(yú)NM_001020484.1、雞NM_001006589.2。

1.2 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用DNAMAN軟件對(duì)不同物種BMP15基因和蛋白序列進(jìn)行同源性比對(duì)，分析BMP15基因和蛋白在山羊與其他物種間的進(jìn)化關(guān)系。利用ProtParm在線程序(http://web. expasy. org/cgi-bin/protparam/protparam)和BioXM軟件對(duì)山羊BMP15蛋白序列進(jìn)行理化參數(shù)分析，包括分子質(zhì)量、氨基酸組成、脂肪系數(shù)、等電點(diǎn)預(yù)測(cè)等參數(shù)。利用ProtScale在線程序(http://web.expasy.org/protscale/)對(duì)山羊BMP15蛋白進(jìn)行疏水性分析。利用SignalP在線程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)BMP15蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽功能分析。利用TMHMM在線程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)進(jìn)行BMP15蛋白質(zhì)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析。利用PredicProtein(https://www.predictprotein.org/home)和PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/ secpred_hnn.pl)在線程序?qū)MP15蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用prosite和Smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線程序(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)對(duì)蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用ProtFun(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)在線程序進(jìn)行蛋白功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊BMP15基因序列分析

對(duì)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的山羊BMP15基因cDNA序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可知BMP15基因包含一個(gè)長(zhǎng)1 185 bp完整的ORF。山羊BMP15基因四種堿基A、T、C、G數(shù)目分別為23.4%、24. 5%、27.6%和24.5% ，AT和GC 含量相對(duì)平衡。

2.2 山羊BMP15蛋白序列分析

山羊BMP15基因共編碼蛋白394個(gè)氨基酸(表1)，脯氨酸含量最高，達(dá)到18.6%，亮氨酸次之，達(dá)到12.9%。ASP和Glu總數(shù)量為30，二者攜帶正電荷；Arg和Lys總數(shù)量為43，二者攜帶負(fù)電荷。其蛋白分子式為C2080H3180N578O552S16，理論等電點(diǎn)為9.44，消光系數(shù)在280 nm時(shí)為69 370，不穩(wěn)定系數(shù)稍高為47.24，大于40，說(shuō)明BMP15是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白。總平均親水性為-0.342，脂肪系數(shù)即疏水值為91.75，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白。

2.3 物種間同源性分析

不同物種間BMP15 cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，山羊與綿羊、牛、豬、人、雞和斑馬魚(yú)同源性分別為92%、98%、91%、83%、78%、54%和47%。不同物種間BMP15編碼的蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，山羊與綿羊、牛、豬、人、雞和斑馬魚(yú)同源性分別為99%、98%、90%、77%、71%、45%和32%(圖1)。山羊與綿羊、牛、人和豬BMP15基因序列及其編碼的蛋白之間同源性較高，山羊與雞和斑馬魚(yú)BMP15基因同源性與BMP15編碼的蛋白同源性相比相差稍大。

表1 山羊BMP15基因編碼的氨基酸組成Table 1 The compositions of Amino acids encoded by goat BMP15 gene

2.4 BMP15編碼的蛋白疏水性分析

利用ProtScale在線網(wǎng)站程序分析BMP15蛋白疏水性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)BMP15多肽鏈表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性(圖2)，ProtParm在線網(wǎng)站程序預(yù)測(cè)的理化參數(shù)總平均親水性為-0.342，二者得出相同的推論，即BMP15蛋白是一種可溶性蛋白。在BMP15多肽鏈第13位甘氨酸具有最高的分值2.933，第57位精氨酸具有最低的分值-3.044。

2.5 BMP15蛋白信號(hào)肽分析

利用SignalP在線網(wǎng)站程序分析BMP15蛋白，得到C、Y、S和D值分別為0.614、0.732、0.991和0.815(圖3)，在25和26位氨基酸之間有剪切位點(diǎn)的可能性較大，可以得出推論BMP15蛋白存在信號(hào)肽，且是個(gè)分泌型蛋白。另外，S-mean 值為1-24，推測(cè)信號(hào)肽長(zhǎng)度為24。

2.6 BMP15蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

利用KinasePhos在線網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)程序?qū)MP15蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)無(wú)磷酸化修飾位點(diǎn)。利用TMHMM在線網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)程序?qū)MP15蛋白的跨膜區(qū)分析，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其無(wú)跨膜區(qū)(圖4)。

2.7 BMP15蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用COILS進(jìn)行BMP15蛋白卷曲螺旋預(yù)測(cè)，得到以14窗口顯示在55～60位氨基酸存在卷曲螺旋(圖5)。利用PredicProtein和PRABI預(yù)測(cè)出山羊BMP15蛋白中含有α-螺旋133個(gè)，占33.76%；無(wú)規(guī)卷曲有209個(gè)，占53.05%(圖6)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)卷曲為主。

2.8 BMP15的功能域預(yù)測(cè)

利用Smart在線網(wǎng)站程序?qū)MP15蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，表明BMP15有TGFβ功能結(jié)構(gòu)域，位于293～394氨基酸區(qū)域(圖7 B)。利用Prosite在線網(wǎng)站程序預(yù)測(cè)得到1條序列譜(TGFβ-2)和1條模式(TGFβ-1)與BMP15匹配(圖7 A)，二者均屬于TGFβ超家族。TGFβ-2 和TGFβ-1編碼蛋白的活性區(qū)域分別位于266～394和311～326，二者對(duì)細(xì)胞增殖分化調(diào)控有重要的作用。利用ProtFun在線網(wǎng)站程序?qū)MP15蛋白功能預(yù)測(cè)，得到山羊BMP15具有細(xì)胞外被膜、中間代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合和生物合成輔助因子功能的可能性分別為12.822、3.785、1.549和1.531(表2)，其中細(xì)胞外被膜功能的可能性最大，推測(cè)其合成后可能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外膜上進(jìn)行功能反應(yīng)。在基因本體范疇中，BMP15作為激素的可能性最大，為5.707。

圖1 BMP15基因及其編碼的蛋白同源性分析A. BMP15基因同源性分析；B. BMP15基因編碼的蛋白同源性分析Fig. 1 The homology analysis of BMP15 gene and its encoding protein

圖2 BMP15編碼的蛋白疏水性分析Fig. 2 The analysis of hydrophobicity of the encoded protein by BMP15

圖3 信號(hào)肽分析Fig. 3 Prediction of signal peptide

圖4 跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig. 4 Prediction of tranamembrane region

圖5 COILS程序分析BMP15蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)Fig. 5 The analysis of BMP15 protein coiled by COILS program

3 討 論

用生物信息學(xué)技術(shù)來(lái)分析基因及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)與功能，能為我們進(jìn)一步研究基因功能做導(dǎo)向，奠定一定的理論基礎(chǔ)。在本研究中，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得到山羊BMP15基因包含一個(gè)長(zhǎng)1 185 bp完整的ORF，編碼394個(gè)氨基酸。BMP15蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定的堿性蛋白。通過(guò)疏水性分析和理化參數(shù)分析得到BMP15蛋白可能是親水性蛋白。

不同物種間BMP15基因及其編碼序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，山羊與綿羊、牛、人和豬之間同源性較高，山羊與雞和斑馬魚(yú)同源性較低。這提示了在哺乳動(dòng)物中BMP15基因進(jìn)化比較保守，其蛋白功能是否存在差異還需要進(jìn)一步的研究。

圖6 山羊BMP15蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)h.α-螺旋；e. β-折疊；c.無(wú)規(guī)則卷曲Fig. 6 The prediction of secondary structure of goat BMP15 proteinh. α-helix；e. β-sheet；c. random coil

在利用SignalP做信號(hào)肽分析時(shí)，某位點(diǎn)C值高，則該位點(diǎn)有很大可能是剪切位點(diǎn)，Y值最高點(diǎn)一般認(rèn)為是最佳的剪切位點(diǎn)，S值低分和高分位置分別表示氨基酸位于成熟蛋白和信號(hào)肽部位，D值可以區(qū)分分泌及非分泌蛋白，分泌蛋白計(jì)算值高[12-13]。在本研究中C、Y最高值位于第26位位點(diǎn)，D值為0.815，因此推測(cè)BMP15蛋白存在信號(hào)肽，在25和26位氨基酸之間可能存在最佳剪切位點(diǎn)，且是個(gè)分泌型蛋白。徐洋洋(2015)研究發(fā)現(xiàn)[14]，倉(cāng)鼠BMP15 蛋白在 27～28 處可能存在最佳剪切位點(diǎn)，與本研究最佳剪切位點(diǎn)有所不同，這可能是由于倉(cāng)鼠和山羊BMP15蛋白序列存在差異。

激素是一種由內(nèi)分泌細(xì)胞分泌，在體內(nèi)作為信使傳遞信息，對(duì)機(jī)體的代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等生理過(guò)程起調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)。利用ProtFun在線網(wǎng)站程序?qū)MP15蛋白功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在基因本體范疇中，山羊BMP15作為激素的可能性最大，這說(shuō)明BMP15可能作為一種激素來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育等活動(dòng)。劉世佳等[15]研究發(fā)現(xiàn)綿羊BMP15作為激素參與生物學(xué)過(guò)程的可能性最高，與本研究結(jié)果相同。另外，本研究發(fā)現(xiàn)BMP15有TGFβ功能結(jié)構(gòu)域，同樣，徐洋洋[14]和劉世佳等[15]分別研究倉(cāng)鼠和綿羊BMP15蛋白序列時(shí)發(fā)現(xiàn)均有TGFβ功能結(jié)構(gòu)域，與本研究結(jié)果相同。TGFβ在細(xì)胞增殖分化、胚胎發(fā)生、卵巢發(fā)育、睪丸發(fā)育、器官發(fā)育、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面生理過(guò)程中有重要的調(diào)控作用[16-18]，這與上述預(yù)測(cè)的基因本體范疇可能性最大的激素的功能一致，因此，推測(cè)BMP15可能作為激素參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化、器官生長(zhǎng)發(fā)育等生理活動(dòng)。劉世佳等[15]研究綿羊BMP15在不同組織中的表達(dá)量時(shí)發(fā)現(xiàn)，在母羊中，BMP15在卵巢中的表達(dá)量顯著高于其它組織，在公羊中，BMP15在十二指腸中的表達(dá)量顯著高于其它組織，且在睪丸、肝、腎等其它組織中BMP15均有一定的表達(dá)，結(jié)合預(yù)測(cè)到的BMP15蛋白的功能，可推測(cè)山羊BMP15在十二指腸、睪丸、肝、腎等組織生理過(guò)程中也有重要的作用，這可為深入研究BMP15蛋白功能提供方向及依據(jù)。

表2 山羊BMP15功能預(yù)測(cè)Table 2 The function prediction of goat BMP15

4 結(jié) 論

山羊BMP15 基因及蛋白序列和綿羊、牛的同源性最高，親緣關(guān)系最近。山羊BMP15蛋白可能屬于分泌性蛋白，存在信號(hào)肽，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。山羊BMP15蛋白可能作為激素參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化、器官生長(zhǎng)發(fā)育等生理活動(dòng)。