李玉紅 丁倩男 王勛英 郭航遠(yuǎn)

312000 紹興市人民醫(yī)院麻醉科（李玉紅），醫(yī)學(xué)研究中心（丁倩男），科教處（王勛英），心內(nèi)科（郭航遠(yuǎn)）

腫瘤為高發(fā)病率和高病死率的疾病，統(tǒng)計(jì)資料表明，每10萬(wàn)人有286例患癌，一生中有22%的概率患癌；每10萬(wàn)人有181例患癌死亡，人的一生中有13%的概率死于癌癥[1]。據(jù)紹興市疾病調(diào)查顯示[2]，惡性腫瘤是紹興市居民生命安全的第一殺手，其危害程度日趨上升；腫瘤治療給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制已成為當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)研究的熱點(diǎn)[3]。目前實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究是惡性腫瘤研究的重要手段，而足夠數(shù)量的腫瘤標(biāo)本是實(shí)驗(yàn)研究的前提和基礎(chǔ)，所以系統(tǒng)化收集腫瘤患者的標(biāo)本，是腫瘤實(shí)驗(yàn)研究的必備條件[4]。為了充分保護(hù)和合理利用紹興地區(qū)高發(fā)腫瘤[3]的樣本資源，為將來(lái)腫瘤研究提供合適數(shù)量，優(yōu)質(zhì)的腫瘤標(biāo)本，為縮短課題研究周期，促進(jìn)腫瘤研究，在紹興市人民醫(yī)院建設(shè)紹興地區(qū)高發(fā)腫瘤生物標(biāo)本庫(kù)。腫瘤生物樣本庫(kù)充分利用紹興地區(qū)最大的綜合性三甲醫(yī)院醫(yī)療優(yōu)勢(shì)，合理收集手術(shù)切除的腫瘤組織和患者血液標(biāo)本，并對(duì)其進(jìn)行低溫冷凍保存，同時(shí)建立規(guī)范的信息系統(tǒng)保存樣本信息和患者的臨床信息，為研究者開(kāi)展腫瘤研究工作提供標(biāo)本資源和服務(wù)平臺(tái)。

1 材料和方法

1.1 硬件系統(tǒng)建設(shè)

1.1.1 用房建設(shè) 包括標(biāo)本存儲(chǔ)室、標(biāo)本處置室和配套的公共實(shí)驗(yàn)室和辦公室。標(biāo)本存儲(chǔ)室用于標(biāo)本的存儲(chǔ)；標(biāo)本處置室用于組織標(biāo)本和血液標(biāo)本的預(yù)處理；配套的公共實(shí)驗(yàn)室用于存儲(chǔ)生物樣本的質(zhì)量控制以及使用生物樣本開(kāi)展科學(xué)研究。醫(yī)院手術(shù)室清潔走廊設(shè)置采樣間，采樣間擁有良好的通風(fēng)系統(tǒng)，配置采樣臺(tái)、采樣器具、照相設(shè)備和便攜式液氮罐；辦公室安裝樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng)和溫度監(jiān)控系統(tǒng)。樣本存儲(chǔ)室由紹興市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心庫(kù)房改造而成，面積約50m2，建設(shè)要求如下：（1）強(qiáng)電：要求每臺(tái)冰箱均配16A三角插座，每2臺(tái)冰箱配置1個(gè)30A空氣開(kāi)關(guān)，連接4mm2電線(xiàn)；每臺(tái)5匹空調(diào)配4mm2電線(xiàn)，需1個(gè)30A空氣開(kāi)關(guān)。注意預(yù)留環(huán)境、設(shè)備、視頻監(jiān)控的線(xiàn)路和插座。需要備用電源接入。（2）弱電：超低溫冰箱區(qū)建議預(yù)留2個(gè)網(wǎng)絡(luò)接口，供環(huán)境、設(shè)備監(jiān)控使用或留作樣本出入庫(kù)電腦聯(lián)網(wǎng)備用。每個(gè)網(wǎng)絡(luò)接口周?chē)A(yù)留強(qiáng)電插座（10A）。（3）地面處理：用環(huán)氧樹(shù)脂處理，達(dá)到防潮、防濕、防靜電的效果。（4）通風(fēng)系統(tǒng)：本區(qū)域按每小時(shí)保證換氣至少8次計(jì)算，至少需要排風(fēng)量1 200m3/h。（5）消防系統(tǒng)：配備煙霧報(bào)警及基礎(chǔ)消防設(shè)施，避免使用水噴淋和干粉滅火，建議使用二氧化碳滅火。

圖1 樣本庫(kù)存儲(chǔ)室平面圖

1.1.2 設(shè)備建設(shè) 冷鏈樣本存儲(chǔ)設(shè)備包括：-80℃深低溫冰箱、液氮罐、-20℃冰柜、4℃試劑保存柜，以及以1:1原則備用深低溫冰箱，確保停電或者設(shè)備故障維修時(shí)生物樣本庫(kù)依舊能夠正常運(yùn)行；輔助設(shè)備包括：血液標(biāo)本預(yù)處理所需的通風(fēng)柜或者生物安全柜、低溫高速離心機(jī)、常溫離心機(jī)、高壓滅菌器、制冰機(jī)等；完成常規(guī)分子生物實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備，如核酸提取儀、PCR儀、全波段酶標(biāo)儀、全波長(zhǎng)分光光度計(jì)以及全能型成像系統(tǒng)等。

1.2 軟件建設(shè)

1.2.1 倫理系統(tǒng)的建立 醫(yī)院原有醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)承擔(dān)樣本庫(kù)涉及的倫理問(wèn)題，樣本庫(kù)建設(shè)作為紹興市重大平臺(tái)項(xiàng)目，該項(xiàng)目建設(shè)方案遞交倫理委員會(huì)討論并通過(guò)（倫理編號(hào)為：2017017），每一例患者熟悉標(biāo)本采集和回訪(fǎng)過(guò)程，簽署同意書(shū)，同意手術(shù)切除組織樣本、血液樣本捐贈(zèng)以及接受出院后回訪(fǎng)。

1.2.2 信息系統(tǒng)建設(shè) 購(gòu)買(mǎi)腫瘤標(biāo)本庫(kù)一套信息管理軟件，軟件預(yù)留鏈接端口，為實(shí)現(xiàn)腫瘤樣本庫(kù)管理軟件與醫(yī)院信息管理系統(tǒng)（hospital information system，HIS）、醫(yī)院檢驗(yàn)系統(tǒng)（Laboratory Information Management System，LIS）以及影像歸檔和通信系統(tǒng)（Picture Archiving and Communication Systems，PACS）等逐步對(duì)接，樣本庫(kù)管理軟件可以自主設(shè)置不同字段，其主要內(nèi)容有：患者一般資料、標(biāo)本一般資料、標(biāo)本存放位置資料、標(biāo)本使用情況、標(biāo)本質(zhì)控信息、標(biāo)本廢除信息以及綜合查詢(xún)等。

1.2.3 監(jiān)控系統(tǒng)建設(shè) 所有冷鏈設(shè)備均安裝溫度監(jiān)控系統(tǒng)，同時(shí)安裝斷電報(bào)警系統(tǒng)。

1.2.4 建設(shè)各項(xiàng)制度和標(biāo)準(zhǔn)操作文件 結(jié)合國(guó)際生物和環(huán)境樣本庫(kù)協(xié)會(huì)（The Institute for Social Behavioral and Economic Research，ISBRE）最佳實(shí)踐[5]及中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)[6]，制定標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)制度，涵蓋樣本信息管理、安全管理、質(zhì)量管理、設(shè)施建設(shè)、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程等，指導(dǎo)腫瘤生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)。

1.2.5 專(zhuān)業(yè)人員的培訓(xùn) 招聘標(biāo)本庫(kù)工作專(zhuān)業(yè)人員2名，首先在醫(yī)院病理科接收病理取材專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，確保癌組織、癌旁組織及正常組織的區(qū)分；其次送往具有成熟經(jīng)驗(yàn)的生物樣本庫(kù)中心集中培訓(xùn)，培訓(xùn)患者知情同意過(guò)程、組織或者血液樣本采集流程，以及樣本庫(kù)信息化管理、質(zhì)量控制等。專(zhuān)職人員專(zhuān)職從事標(biāo)本收集、處理、質(zhì)量控制和標(biāo)本管理等工作。

1.3 標(biāo)本采集 腫瘤生物樣本庫(kù)標(biāo)本采集流程為：（1）患者或者家屬知情同意，主管醫(yī)生判斷是否符合納入標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病例，主管醫(yī)生與患者家屬以及患者本人討論，告知參加標(biāo)本庫(kù)捐贈(zèng)程序、患者需要承擔(dān)任務(wù)和以及可能的風(fēng)險(xiǎn)、患者在此過(guò)程中享受的權(quán)益等?；颊吆图覍僭敢饩栀?zèng)組織和血液樣本，由主管醫(yī)生、患者或者其代理人共同簽署知情同意書(shū)；（2）主管醫(yī)生填寫(xiě)組織和血液標(biāo)本采集通知單，通知標(biāo)本庫(kù)工作人員。（3）標(biāo)本庫(kù)工作人員每天查閱手術(shù)通知單，對(duì)當(dāng)天納入手術(shù)患者打印標(biāo)簽貼，準(zhǔn)備凍存管，患者入手術(shù)室，手術(shù)室護(hù)士通知標(biāo)本庫(kù)工作人員采集血標(biāo)本；腫瘤組織切除之前，手術(shù)室護(hù)士通知標(biāo)本庫(kù)工作人員采集組織標(biāo)本，當(dāng)腫瘤組織直徑＞1cm，采集部分腫瘤組織標(biāo)本，其余送病理檢查；腫瘤組織直徑＜1cm，全部送病理檢查，放棄留取標(biāo)本。（4）組織標(biāo)本立刻置于液氮速凍，同步將標(biāo)本信息錄入標(biāo)本庫(kù)管理系統(tǒng)，包括患者住院號(hào)、初步診斷、大體標(biāo)本切除時(shí)間等。（5）標(biāo)本速凍30min后置于－80℃深低溫或者－196℃液氮罐凍存（見(jiàn)圖2）。

圖2 樣本采集流程圖

1.3.1 組織標(biāo)本采集 組織標(biāo)本為手術(shù)切除大體標(biāo)本或者穿刺活檢標(biāo)本，每例患者組織標(biāo)本包括癌組織、癌旁組織和遠(yuǎn)端正常組織。每管組織量0.5g左右，分割成0.2～0.5cm的組織塊，癌組織、癌旁組織以及正常組織各分3～5管保存。每一例手術(shù)切除大體標(biāo)本拍照，并記錄熱缺血、腫瘤部位和范圍等資料。

1.3.2 血液標(biāo)本的收集 每次患者采集空腹血標(biāo)本5～8ml，詳細(xì)記錄抽血時(shí)間和抽血量。血液標(biāo)本分成不抗凝和EDTA抗凝2管，在室溫放置1h后開(kāi)始離心（3 000r/min，10min），離心結(jié)束后吸取上層血清或血漿、抗凝管下層血細(xì)胞，按每管200～300μl液體分裝，統(tǒng)一編號(hào)，存放入－80℃深低溫冰箱。

1.4 生物樣本庫(kù)建設(shè)的質(zhì)量控制 納入標(biāo)本捐贈(zèng)患者的知情同意書(shū)簽署所占的比例；每一個(gè)組織標(biāo)本采集記錄熱缺血時(shí)間；術(shù)后定期隨訪(fǎng)患者所占的比例；隨機(jī)方法按照1/1 000的比例抽取部分樣本，采用蘇木素和伊紅染色評(píng)估組織樣本取材的準(zhǔn)確性；RNA抽提使用Prepito RNA Tissue 250 Kit（德國(guó)Perkin Elmer公司）。利用分光光度計(jì)（美國(guó)Nano Drop2000）測(cè)定A260/A280比值。

2 結(jié)果

2.1 樣本采集和信息錄入 自紹興地區(qū)高發(fā)腫瘤生物樣本庫(kù)建設(shè)以來(lái)，以紹興地區(qū)高發(fā)腫瘤組織、血液收集為主，截止至2015年5月已收集218例患者的組織和（或）血液標(biāo)本，其中手術(shù)腫瘤組織標(biāo)本1 875份、血液標(biāo)本2 008份、糞便標(biāo)本122管以及骨髓標(biāo)本14管（見(jiàn)表1），與標(biāo)本相對(duì)應(yīng)的臨床信息完整度達(dá)100%。

表1 紹興地區(qū)高發(fā)腫瘤標(biāo)本庫(kù)收集腫瘤標(biāo)本種類(lèi)和數(shù)量（份）

圖3 腫瘤患者組織采集熱缺血時(shí)間（m in）

2.2 組織樣本熱缺血時(shí)間 218例腫瘤患者組織標(biāo)本熱缺血時(shí)間平均值為（12±3）min，見(jiàn)圖 3。

圖4 組織標(biāo)本RNA純度檢測(cè)A260/A280

2.3 組織樣本RNA純度測(cè)定 抽取10份組織標(biāo)本，A260/A280值為 1.92±0.02，見(jiàn)圖 4。

3 討論

經(jīng)手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本是現(xiàn)代腫瘤研究的重要材料，是不可再生資源。自1990年來(lái)，腫瘤標(biāo)本進(jìn)行科學(xué)化管理和合理利用引起世界各地腫瘤研究者的重視，在此基礎(chǔ)上腫瘤生物標(biāo)本庫(kù)逐漸建立和完善。目前，國(guó)內(nèi)外眾多知名腫瘤研究單位也紛紛建立腫瘤生物標(biāo)本庫(kù)，如ISBRE[7]、泛歐洲生物樣本庫(kù)與分子生物資源研究中心（Biobanking and Molecular Research Infrastructure，BBMRI）[8]、美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（National Cancer Insti－tute，NCI）[9]。2004年美國(guó)癌癥基金會(huì)資助天津腫瘤醫(yī)院建立組織庫(kù)[10]，2005年北大腫瘤醫(yī)院建立北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院標(biāo)本庫(kù)[11]，2006年紐約中華醫(yī)學(xué)基金會(huì)資助中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院建立腫瘤資源庫(kù)[12]。

紹興地區(qū)地處江南水鄉(xiāng)，氣候潮濕，食物易霉變，紹興地區(qū)居民飲食偏愛(ài)霉干菜、霉豆腐等食物；另外，紹興地區(qū)工業(yè)發(fā)達(dá)，尤其印染工業(yè)據(jù)國(guó)內(nèi)前列。上述原因可能導(dǎo)致該地區(qū)胃腸道腫瘤、肺癌以及血液系統(tǒng)癌癥高發(fā)。針對(duì)該地區(qū)高發(fā)腫瘤建立腫瘤生物樣本庫(kù)，通過(guò)積極采集和合理存儲(chǔ)常見(jiàn)腫瘤組織、血液等標(biāo)本，對(duì)其進(jìn)行規(guī)范科學(xué)化的管理和質(zhì)量監(jiān)測(cè)，為基礎(chǔ)和臨床研究提供大量的高質(zhì)量生物樣本資源。紹興市人民醫(yī)院有穩(wěn)定的腫瘤標(biāo)本來(lái)源，可以保證腫瘤生物樣本庫(kù)庫(kù)存標(biāo)本數(shù)量不斷補(bǔ)充。紹興市腫瘤生物樣本庫(kù)有2名專(zhuān)職工作人員負(fù)責(zé)標(biāo)本的收集、處理、凍存等日常工作，并制定了一系列管理制度，技術(shù)路線(xiàn)和操作流程已經(jīng)基本趨于規(guī)范。院領(lǐng)導(dǎo)的頂層設(shè)計(jì)、對(duì)標(biāo)本庫(kù)重要性的高度認(rèn)識(shí)以及大力支持是標(biāo)本庫(kù)建設(shè)成功的關(guān)鍵因素；標(biāo)本庫(kù)主管負(fù)責(zé)人與各科室包括信息科、病理科以及各臨床科室的協(xié)調(diào)配合是標(biāo)本庫(kù)順利開(kāi)展的重要保證；另外，收集合格的標(biāo)本則取決于標(biāo)本采集和標(biāo)本保存過(guò)程以及臨床資料的完整性。

首先是標(biāo)本采集，組織標(biāo)本采集的關(guān)鍵包括準(zhǔn)確定位標(biāo)本取材部位，標(biāo)本采集人員需要經(jīng)過(guò)病理取材專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，才能確保癌組織、癌旁組織及正常組織的區(qū)分。利用常規(guī)病理檢測(cè)方法對(duì)留取標(biāo)本進(jìn)行病理組織學(xué)鑒定，若其中的腫瘤成分超過(guò)75%則認(rèn)為質(zhì)量良好，如不足65%則應(yīng)從研究中剔除[13]。筆者考慮病理組織學(xué)鑒定將在樣本出庫(kù)，為研究者提供樣本時(shí)檢測(cè)。為了保證組織標(biāo)本質(zhì)量，避免DNA、RNA和蛋白質(zhì)的降解，既往研究提示嚴(yán)格控制標(biāo)本離體時(shí)間（熱缺血）30min以?xún)?nèi)將組織置于冷鏈中儲(chǔ)存[14－15]；另外工作人員操作過(guò)程中避免標(biāo)本污染（自身污染和環(huán)境污染）以確保標(biāo)本質(zhì)量，同一標(biāo)本不同部位的取材必須更換刀片，取材避開(kāi)壞死部位[16]。筆者腫瘤生物樣本庫(kù)建設(shè)過(guò)程中，記錄每例患者組織樣本熱缺血時(shí)間，結(jié)果顯示均控制在20min以?xún)?nèi)。

其次是標(biāo)本保存，低溫凍存被公認(rèn)是組織長(zhǎng)期保存的有效方法之一，其原理是通過(guò)降低細(xì)胞代謝率起到保護(hù)組織的作用[17]。目前，國(guó)內(nèi)外大型腫瘤組織庫(kù)以采用－80℃深低溫冰箱儲(chǔ)存為主，對(duì)于低溫環(huán)境下生物大分子活力保存，很多學(xué)者進(jìn)行了一些列研究，張佳年等[18]納入上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院上海消化外科研究所腫瘤樣本庫(kù)2002至2006年手術(shù)切除胃癌標(biāo)本，探索低溫技術(shù)對(duì)腫瘤生物大分子的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織樣本低溫保存5年范圍內(nèi)，其DNA分子的完整性與質(zhì)量均未受影響；RNA與蛋白質(zhì)分子在低溫保存1～2年內(nèi)尚不影響癌基因表達(dá)的分析結(jié)果，但低溫保存3年或以上的標(biāo)本中RNA及蛋白質(zhì)均有不同程度降解。該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究納入0～10年的手術(shù)切除胃癌組織標(biāo)本，結(jié)果提示：組織標(biāo)本長(zhǎng)期低溫凍存對(duì)DNA影響最小，超過(guò)5年組RNA和大分子量蛋白質(zhì)降解較多，但是小分子量蛋白質(zhì)保存完好[19]。RNA分子容易被廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)、皮膚、唾液、汗水及周?chē)h(huán)境中的RNA酶所降解，液氮保存是保存RNA活性最理想的方法，當(dāng)溫度降至液氮溫度時(shí)，細(xì)胞組織中所有的生物化學(xué)、生物物理過(guò)程均處于停止?fàn)顟B(tài)[20]，但限于空間及經(jīng)費(fèi)等原因，大型液氮罐儲(chǔ)存或者液氮冰箱難以推廣普及。

高質(zhì)量的標(biāo)本，提供高質(zhì)量的DNA和RNA，對(duì)下游分析結(jié)果起至關(guān)重要的作用，標(biāo)本庫(kù)的質(zhì)量控制歸根結(jié)底是生物大分子的質(zhì)量控制[21]?；蚪MDNA質(zhì)量檢測(cè)主要包括：基因組DNA片段大小的確定，DNA濃度和純度測(cè)定3方面。檢測(cè)技術(shù)有：瓊脂糖凝膠電泳（確定片段大小），根據(jù)條帶判斷其完整性[22]；不同成分的樣品會(huì)有不同的吸光度：260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，280nm則是蛋白和酚類(lèi)。一般用A260/A280來(lái)檢驗(yàn)DNA和RNA的純度，純DNA的A260/A280比值約為1.8左右，而純RNA約為2.0左右。過(guò)低表明有蛋白質(zhì)污染[23]。對(duì)于組織RNA的質(zhì)量分析主要依據(jù)28S與18S的比值進(jìn)行，比值在2認(rèn)為質(zhì)量好，比值＜1則認(rèn)為RNA已降解。28S和18S是真核生物rRNA（核糖體RNA）的兩個(gè)亞基，在體內(nèi)含量較多。RNA提取過(guò)程中可能發(fā)生各種突進(jìn)的降解，28S/18S即為衡量提取的RNA完整性的指標(biāo)，如果28S/18S為2，表明所提取的RNA完整性較好，基本無(wú)降解發(fā)生。本研究中，抽取10管組織，提取RNA，紫外分光光度計(jì)A260/A280，結(jié)果顯示均在1.9。尚未進(jìn)行DNA和蛋白質(zhì)量以及其它質(zhì)控檢測(cè)，另外還需要進(jìn)行管家基因和目的基因的擴(kuò)增以判斷腫瘤標(biāo)本質(zhì)量的優(yōu)劣[24]，從而促進(jìn)臨床研究質(zhì)量和水平的提升[25]。

綜上所述，醫(yī)學(xué)臨床研究與基礎(chǔ)研究的發(fā)展總是離不開(kāi)多方合作，腫瘤生物標(biāo)本庫(kù)在充分利用自身資源合理發(fā)展的同時(shí)，也在尋找機(jī)會(huì)與省內(nèi)外以及國(guó)內(nèi)外專(zhuān)業(yè)腫瘤標(biāo)本庫(kù)建立合作關(guān)系，利用與省內(nèi)外知名科研機(jī)構(gòu)建立起的良好的科技合作機(jī)制，通過(guò)加強(qiáng)與知名研究機(jī)構(gòu)的合作交流，加快建設(shè)具有地區(qū)特色的腫瘤研究交流平臺(tái)。