曹永 鄭慧哲 金在順 呂強（通訊作者） 高曉虹（通訊作者）

（1遵義醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理教研室 貴州 遵義 563099）

（2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院 黑龍江 牡丹江 157011）

（3牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 黑龍江 牡丹江 157011）

（4遵義醫(yī)學(xué)院生理教研室 貴州 遵義 563099）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是一種多基因疾病，由抑制基因、致癌基因、錯配修復(fù)基因以及細胞周期調(diào)控基因的改變引起[1]。雖然近年相繼報道了一些腫瘤干細胞標記物如CD133、CD44等以及結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)分子標記物如IMP3、S100A2等[2]，但隨著干細胞標記物的深入研究證實多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與CD44v6有密切關(guān)系[3]，CD44v6是最早發(fā)現(xiàn)的一種CD44粘附分子，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起重要促進作用[4]，但CD44v6是否可作為獨立判斷結(jié)直腸癌預(yù)后標記物的研究報道甚少。因此，本研究擬聯(lián)合檢測CD44v6和Transgelin、Transgelin2在結(jié)直腸癌中的表達，并分析其與臨床病理特征及對預(yù)后生存的影響。

1.材料與方法

1.1 材料

收集徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（2005～2008年）資料完整的原發(fā)性結(jié)直腸癌112例及相應(yīng)癌旁組織，男62例，女50例，年齡21～87歲，平均53.6歲，病例依據(jù)（AJCC）TNM分期標準：Ⅰ、Ⅱ期59例，Ⅲ、Ⅳ期53例，低分化32例，高-中分化80例（表1）。實驗標本征得徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 試劑和方法

標本制成組織微陣列（tissue microarray，TMA），厚4um連續(xù)切片，采用S-P（streptavidin-perosidase）試劑盒（福州邁新）檢測3種抗體：CD44v6（ABD serotec，貨號∶MCA1730）、Transgelin（Proteintech，貨號：10493-1-AP）和Transgelin2（Proteintech，貨號：10234-2-AP）。Transgelin、Transgelin2（1∶150稀釋）、CD44v6（1∶200稀釋），用0.01mol/L枸櫞酸鹽酸緩沖液（pH6.0）高溫高壓法行抗原修復(fù)，PBS液代替一抗做空白對照。

1.3 結(jié)果判定

分析陽性細胞占同類細胞的百分比及陽性細胞的著色強度，判斷免疫組化結(jié)果。三種蛋白均成棕褐色表達，CD44v6線性表達于細胞膜，Transgelin顆粒狀表達于細胞核，Transgelin2顆粒狀表達于胞漿；每例標本觀察5個視野（400倍），計算陽性細胞數(shù)，染色強度：無染色為0，輕度染色為1，中度染色為2，強染色為3；陽性細胞所占百分比：0分為陽性細胞＜10%，1分為10%～30%，2分為30%～50%，3分為50%～70%，4分為70%～100%，兩種積分相乘，依照0為陰性（-），1～3為弱陽性（+），4～8為陽性（++），9～12為強陽性（+++）。免疫組化結(jié)果由兩名病理科醫(yī)生獨立判讀，判讀結(jié)果不一致時，由第三方病理醫(yī)生參與協(xié)商做出判讀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0和Stata12.0進行統(tǒng)計分析，分別用以秩和檢驗、Pearman相關(guān)分析、Kaplan-Meier生存分析、Cox模型分析。

2.結(jié)果

2.1 CD44v6、Transgelin、Transgelin2 表達

三種蛋白均為棕褐色表達，CD44v6在112例結(jié)直腸癌中陽性表達74例（66.1%），呈線性分布于癌細胞膜，癌巢及周邊區(qū)域表達明顯增強（圖1-A、B、C、D），癌旁無表達。Transgelin有94例（83.9%）陽性表達，呈顆粒狀表達于細胞核，（圖1-E、F、G、H），癌旁間質(zhì)偶有表達。Transgelin2有71例（63.4%）呈棕褐色顆粒表達于癌細胞漿，（圖1-I，J、K、L），癌旁組織偶有表達。

圖1 CD44v6、Transgelin和Transgelin2免疫組化染色

2.2 Transgelin、Transgelin2、CD44v6表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

CD44v6與結(jié)直腸癌腫瘤大?。é?=22.002，P=0.000）、AJCC分期（χ2=30.023，P=0.000）、組織學(xué)分級（χ2=14.638，P=0.002）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=34.504，P=0.000）密切相關(guān)；Transgelin與組織學(xué)分級（χ2=22.409，P=0.000）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=7.932，P=0.047）顯著相關(guān)；Transgelin2與AJCC分期（χ2=32.594，P=0.000），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=12.406，P=0.006）顯著相關(guān)。

2.3 CD44v6、Transgelin、Transgelin2的相關(guān)關(guān)系

結(jié)直腸癌中Transgelin 和Transgelin2為負相關(guān)性（r=-0.228，P=0.016），Transgelin和CD44v6無相關(guān)性（P＞0.05），Transgelin2和 CD44v6呈正相關(guān)（r=0.556，P=0.000），Transgelin2和CD44v6在結(jié)直腸癌中起相互促進作用。

2.4 CD44v6、Transgelin、Transgelin2表達與各臨床病理參數(shù)對患者預(yù)后影響

Kaplan-Meier生存分析如圖2示，CD44v6陽性患者術(shù)后五年生存率明顯低于陰性患者（P=0.000）（圖2-i），而Transgelin、Transgelin2表達患者術(shù)后五年生存率與陰性患者無顯著差異（P=0.386，P=0.982）（圖2-g，h）；腫瘤大小，AJCC分期，組織學(xué)分級，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（圖2-c，d，e，f）均與預(yù)后明顯相關(guān)（P=0.000），而性別、年齡與生存無關(guān)（P=0.956，P=0.508）（圖2-a，b）。

圖2 CD44v6、Transgelin、Transgelin2與臨床病理特征的Kaplan-Meier分析

2.5 Cox模型分析

經(jīng)Cox分析顯示：腫瘤大小[HR（95%CI）：0.573（0.361～0.908）；P=0.018]、組織學(xué)分級（Poor）[HR（95%CI）：13.408（5.330～33.728）；P=0.000]、AJCC 分期（Ⅲ+Ⅳ）[HR（95%CI）：5.051（2.959～8.621）；P=0.000]、 CD44v6[HR（95%CI）：0.277（0.131～0.587）；P=0.001]均可作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的指標。（HR：hazard ratio；CI∶confidence interval）

3.討論

人類CD44基因因其結(jié)構(gòu)中外顯子的差異分為：CD44（s）標準型和CD44（v）變異型[5]，而CD44v6是最早發(fā)現(xiàn)的一種CD44粘附分子，在腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起重要促進作用[4，6]。已證實乳腺癌等多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移都與CD44v6有密切關(guān)系[3]。Matilde Todaro等[7]發(fā)現(xiàn)CD44v6可能是一個功能性生物標記分子又是結(jié)直腸癌干細胞治療性靶點之一。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中CD44v6表達顯著高于癌旁組織，并且CD44v6表達與腫瘤大小、AJCC分期、組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均關(guān)系密切，并隨著腫瘤細胞分裂增多，癌巢周邊其陽性表達增強，可能與腫瘤干細胞分裂旺盛及蛋白表達增多相關(guān)。本研究通過Kaplan-Meier和Cox分析發(fā)現(xiàn)，CD44v6表達患者術(shù)后五年生存率明顯低于陰性患者，進一步明確CD44v6可作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立標記物。

Transgelin也被稱為SM22[6-8]、轉(zhuǎn)膠蛋白等，并證實存在于細胞骨架中[9]，Transgelin可通過抑制HT1080細胞中MMP9表達而抑制細胞轉(zhuǎn)移[10]。Transgelin2是Transgelin的同系物，其具體功能作用機制不詳。本研究發(fā)現(xiàn)Transgelin表達與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，Transgelin2與結(jié)直腸癌AJCC分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，預(yù)后分析顯示，Transgelin和Transgelin2都不可作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的標記物，但可作為評判腫瘤進展能力的指標。研究還發(fā)現(xiàn)癌組織中Transgelin和Transgelin2的表達均比正常組織增強，其研究結(jié)果與Shields JM[11]、Kaplan-Alberquerque[12]等的研究結(jié)論不同，同時揭示，Transgelin和Transgelin2在結(jié)直腸癌中呈負相關(guān)，即二者在腫瘤發(fā)生發(fā)展中呈相互抑制作用，這在以前研究結(jié)果中鮮有報道。至于Transgelin和Transgelin2在不同惡性腫瘤中表達的不同以及功能的差異，可能因樣本量、地區(qū)差異、實驗試劑等多方面因素導(dǎo)致。

CD44v6和Transgelin2表達呈正相關(guān)，說明CD44v6和Transgelin2的協(xié)同表達在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起相互促進作用，此結(jié)果與Lee等[13]報道轉(zhuǎn)膠蛋白可促進腫瘤干細胞的侵襲和遷移，腫瘤細胞中轉(zhuǎn)膠蛋白的表達量高于非腫瘤細胞中的25倍相符，研究結(jié)果進一步證實轉(zhuǎn)膠蛋白具有促進腫瘤干細胞侵襲和遷移的功能。轉(zhuǎn)膠蛋白在結(jié)直腸癌中即促進腫瘤的發(fā)展又與CD44v6相互作用影響腫瘤惡性進展，但其作用機制尚不清楚。

綜上所述，CD44v6可作為獨立判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的生物標記物，而Transgelin和Transgelin2可作為評判腫瘤進展能力的參考指標。在后續(xù)實驗中將進一步探討三者在分子通路中的相關(guān)作用機制。