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        慢性阻塞性肺疾病小鼠肺組織中Th17/Treg細(xì)胞的變化及意義

        2018-09-07 02:40:50張婧張?zhí)m英歐陽(yáng)瑤通訊作者
        醫(yī)藥前沿 2018年26期
        關(guān)鍵詞:小鼠檢測(cè)模型

        張婧 張?zhí)m英 歐陽(yáng)瑤(通訊作者)

        (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州 遵義 563000)

        慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種常見的可以預(yù)防和治療的呼吸系統(tǒng)疾病,其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)[1]。COPD的發(fā)病與長(zhǎng)期吸煙等有害因素引起的異常炎癥反應(yīng)密切相關(guān),但其具體機(jī)制至今尚不明了。最新研究表明,CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥可能與COPD的發(fā)病有關(guān)[2,3]。輔助性T細(xì)胞 17(Thelpercells 17,Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)是重要的CD4+T細(xì)胞亞群。Th17細(xì)胞可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[4],白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)是它分泌的一種關(guān)鍵性活化因子,可以促使多種細(xì)胞釋放炎性介質(zhì),從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。而Treg細(xì)胞具有免疫抑制作用,不僅能抑制炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,還能抑制炎性細(xì)胞的分化、增殖,叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box protein 3,F(xiàn)oxp3)可以控制它的生長(zhǎng)、分化和功能,是鑒定Treg最可靠的檢測(cè)指標(biāo)。在炎癥性疾病發(fā)病中兩種細(xì)胞在功能上相互拮抗。正常狀態(tài)下,Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞之間的相對(duì)平衡在維持免疫穩(wěn)態(tài)中有決定性意義。若這種平衡被破壞,就會(huì)導(dǎo)致免疫炎癥性疾病發(fā)病[5,6]。

        因此,本研究擬通過煙熏法建立COPD小鼠模型,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的變化,以期為COPD的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

        1.材料

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        SPF級(jí)C57BL/6小鼠26只,雌雄不限,6~8周齡,體重20g~25g,由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào)為SCXK(渝)2012-0005。

        1.2 主要材料

        黃果樹牌香煙(焦油量:11mg;煙氣煙堿量:0.9mg;煙氣一氧化碳量:13mg)(貴州中國(guó)工業(yè)有限責(zé)任公司)。Anti-Mouse CD4 FITC、Rat IgG2a K Isotype Control FITC、Anti-Mouse CD25 PE-Cyanine5、Rat IgG1 K Isotype control PE-Cyanine5、Anti-Mouse/Rat Foxp3 APC Rat IgG2a K Isotype control APC、Anti-Mouse/Rat IL-17A PE、Rat IgG2a K Isotype control PE、Flow Cytometry Staining buffer、Fixation/Permeabilization Concentrate Fixation/Permeabilization Diluent(上述試劑均來自eBioscience公司)。

        2.方法

        2.1 動(dòng)物模型的制備和分組

        將26只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和COPD模型組(n=16)。將16只模型組小鼠置于自制有機(jī)玻璃煙熏箱內(nèi)(大小為90cm×40cm×30cm,箱蓋上有9個(gè)1.5cm×1.5cm大小的通氣孔),每日被動(dòng)吸煙4次,6支煙/次,1h/次,共28天。10只對(duì)照組小鼠則暴露于空氣中,正常飼養(yǎng)。

        2.2 肺組織病理學(xué)檢測(cè)

        取小鼠右肺下葉用4% 的多聚甲醛固定 24 h ,石蠟包埋切片,組織切片進(jìn)行 HE 染色。使用軟件IPWin32采集HE染色切片圖像,隨機(jī)采集多個(gè)完整氣道圖像,最后由我院病理科醫(yī)師分析圖片。

        2.3 制備單細(xì)胞懸液

        在RPMI 1640培養(yǎng)基中加入Ⅳ型膠原酶粉,配制Ⅳ型膠原酶。將肺組織剪碎,放入盛膠原酶的離心管中,置于水浴箱內(nèi)(37℃),直至肺組織消化,收集消化液,過濾至第二個(gè)試管,離心,棄上清;加入2ml PBS,用吸管吹打,離心,棄上清;加入5ml紅細(xì)胞裂解液,裂解直至溶液透明,離心,棄上清;再用PBS漂洗,離心,棄上清;最后加入1ml含1%FBS的PBS及200ul 1%多聚甲醛,振蕩混勻,即為所需懸液。

        2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-17和CD4+CD25+ Foxp3的變化

        CD4+IL-17檢測(cè):在250ul單細(xì)胞懸液中加入250ul RPMI1640培養(yǎng)基,再加入2ul 250×PMA/Ionomycin及2ul 250×Monensin/BFA,置于5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)5h;測(cè)定管加入4ul Anti-Mouse CD4 FITC,對(duì)照管加入4ul Rat IgG2a K Isotype Control FITC;各加入200ul培養(yǎng)好的單細(xì)胞懸液,孵育、固定、漂洗、溶血、破膜,再于測(cè)定管中加入2ulAnti-Mouse/Rat IL-17A PE,對(duì)照管中加入2ulRat IgG2a K IsotypecontrolPE,然后孵育、漂洗,上機(jī)檢測(cè)。

        CD4+CD25+Foxp3檢測(cè):測(cè)定管加入4ul Anti-Mouse CD4 FITC、2ul Anti-Mouse CD25 PE-Cyanine 5,對(duì)照管加入4ul Rat IgG2a K Isotype Control FITC、2ul Rat IgG1 K Isotype control PE-Cyanine 5;各加入200ul單細(xì)胞懸液,孵育、漂洗,漩渦震蕩細(xì)胞沉淀,各管中加入1ml現(xiàn)配制的固定/破膜工作液,再孵育、漂洗;測(cè)定管中加入5ul Anti-Mouse Foxp3 APC,對(duì)照管中加入5ul Rat IgG2a K Isotype control APC,最后孵育、漂洗,上機(jī)檢測(cè)。

        2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        3.結(jié)果

        3.1 兩組小鼠的一般情況

        對(duì)照組:小鼠全身皮毛光澤,精神活動(dòng)正常自如,呼吸平穩(wěn),食欲正常,體重增加,體型飽滿,實(shí)驗(yàn)期間小鼠無(wú)死亡。

        COPD模型組:小鼠全身皮毛干枯、灰暗,精神倦怠,雙眼微閉,活動(dòng)減少,呼吸急促,食欲減退,體重下降,且上述癥狀呈逐漸加重趨勢(shì),煙熏期間小鼠無(wú)死亡。

        3.2 光鏡觀察小鼠肺組織病理特征

        對(duì)照組:肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁完整且連續(xù),肺泡間隔可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖1A)。

        COPD模型組:肺泡結(jié)構(gòu)破壞,多數(shù)肺泡相互融合形成較大的肺泡腔,肺泡間隔有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖1B)。

        圖1 實(shí)驗(yàn)第28天兩組小鼠肺組織HE染色(×200倍)

        3.3 小鼠肺組織中Th17和Treg的百分比含量

        將收集的肺組織標(biāo)本予以處理后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17和Treg的變化,結(jié)果顯示:與對(duì)照組(0.66±0.28)相比,Th17的百分比含量在模型組小鼠肺組織中(2.41±0.33)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。模型組小鼠肺組織中Treg的百分比含量(0.37±0.11)較對(duì)照組(0.93±0.30)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

        表1 兩組小鼠肺組織中Th17和Treg的百分比含量(±s)

        表1 兩組小鼠肺組織中Th17和Treg的百分比含量(±s)

        注:與對(duì)照組(Th17)相比,*P<0.05;與對(duì)照組(Treg)相比,ΔP<0.05。

        組別(例數(shù)) Th17(%) Treg(%)對(duì)照組(n=10) 0.66±0.28 0.93±0.30 CODP 模型組(n=16) 2.41±0.33* 0.37±0.11Δ

        3.4 小鼠肺組織中Th17/Treg的比值

        模型組小鼠肺組織中Th17/Treg的比值(7.26±2.97)高于對(duì)照組(0.50±0.24),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

        表2 兩組小鼠肺組織中Th17/Treg的比值(±s)

        表2 兩組小鼠肺組織中Th17/Treg的比值(±s)

        注:與對(duì)照組相比,*P<0.05。

        組別(例數(shù)) Th17/Treg對(duì)照組(n=10) 0.50±0.24 COPD模型組(n=16) 7.26±2.97*

        4.討論

        COPD是一個(gè)嚴(yán)重危害公眾健康的全球性問題。吸煙被公認(rèn)為COPD發(fā)病最關(guān)鍵的誘發(fā)因素,然而,COPD患者戒煙后肺組織及氣道炎癥仍持續(xù)存在,這表明COPD的發(fā)病機(jī)制可能與自身免疫炎癥有關(guān)。香煙煙霧可能導(dǎo)致T細(xì)胞啟動(dòng)一個(gè)“異?!钡拿庖邞?yīng)答,導(dǎo)致機(jī)體免疫失調(diào),使COPD患者易患呼吸道感染[7]。

        本研究采用煙熏法建立COPD小鼠模型,煙熏第28天取小鼠肺組織行HE染色,觀察肺組織病理形態(tài)變化,結(jié)果顯示:與健康對(duì)照組相比,COPD模型組小鼠有明顯的肺部炎癥及肺氣腫改變,符合人類COPD的特征性病理變化,提示COPD小鼠模型建立成功。

        迄今為止,在COPD的發(fā)病機(jī)制中香煙煙霧對(duì)初始T細(xì)胞的作用尚不明確。因此,本實(shí)驗(yàn)觀察香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD小鼠模型肺組織中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的變化,結(jié)果表明COPD模型組小鼠肺組織中Th17的百分比含量高于對(duì)照組,而Treg的百分比含量則低于對(duì)照組。香煙煙霧是Th17細(xì)胞的一種有效佐劑,它能夠誘導(dǎo)IL-1β、IL-6等效應(yīng)性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[8],這一類細(xì)胞因子又能夠抑制Foxp3的表達(dá)和Treg細(xì)胞的分化,并且使Treg細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化,這可能是COPD中存在Th17/Treg失衡的原因之一。有研究者發(fā)現(xiàn)在慢性過敏性氣道炎癥中Th17細(xì)胞可以抑制Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[9]。也有研究發(fā)現(xiàn)在肺炎支原體抗原誘導(dǎo)的炎癥模型中Treg細(xì)胞又可通過減少IL-17的產(chǎn)生抑制Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫激活[10]。Th17/Treg 失衡與COPD患者的肺功能惡化和疾病進(jìn)展有關(guān)[11]。上述結(jié)果均提示Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失衡在COPD的發(fā)病過程中可能具有重要的作用。

        為了評(píng)估COPD模型組小鼠體內(nèi)Th17/Treg失衡的程度,本研究計(jì)算每一個(gè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中Th17與Treg的比值,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,COPD模型組小鼠肺組織中Th17與Treg的比值增高,提示香煙煙霧打破Th17/Treg的相對(duì)平衡,偏向于Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng),同時(shí)抑制Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用,從而使COPD的炎癥反應(yīng)持續(xù)存在且不斷放大,因此,有效調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡可能是延緩COPD病情進(jìn)展的關(guān)鍵關(guān)節(jié)。

        總之,本研究結(jié)果提示香煙煙霧可能導(dǎo)致Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失衡,提示肺組織中Th17/Treg失衡可能參與COPD的發(fā)病機(jī)制。為了提供COPD患者更好的臨床治療方案,我們?nèi)孕柽M(jìn)一步研究如何調(diào)節(jié)其免疫失衡。

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