李美華，王渭清，曾 陽(yáng)*，郭鳳霞，嚴(yán)培瑛，李錦萍

(1青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西寧 810008；2青海省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)所，西寧 810000；3浙江大學(xué)城市學(xué)院，杭州 310015)

金露梅(PotentillafruticosaL.)屬薔薇科(Rosaceae)委陵菜屬(Potentilla)植物，主要分布在青藏高原，是高寒地區(qū)一種典型的落葉灌木，嫩葉可代茶飲，花和葉可藥用[1]。金露梅屬于民族常用藥藏藥的一種。據(jù)藏藥典籍《晶珠本草》記載，其具有健脾、消暑、調(diào)經(jīng)的功效，現(xiàn)代研究主要對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)金露梅中含有黃酮類、鞣質(zhì)和醌類化合物。

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，食用過(guò)多碳水化合物和高脂高糖類食物致使餐后血糖升高，不僅會(huì)導(dǎo)致肥胖，還會(huì)引發(fā)2型糖尿病[2]。人們現(xiàn)今已研發(fā)出各類抗2型糖尿病的藥物，例如，從微生物和植物中獲得用于降糖及治療肥胖的α-淀粉酶抑制劑類藥物，合成了α-葡萄糖苷酶抑制劑和醛糖還原酶抑制劑類降糖藥物(阿卡波糖、依帕司他)等[3-6]。本課題組前期研究同屬植物小葉金露梅時(shí)發(fā)現(xiàn)，小葉金露梅對(duì)α-葡萄糖苷酶和醛糖還原酶有抑制作用，并具有抗2型糖尿病的作用[7]。本文主要研究了金露梅不同提取物對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和醛糖還原酶3種酶的體外抑制作用以及金露梅提取物對(duì)餐后血糖的影響，為金露梅資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材 料

1.1 藥材與試劑

金露梅枝葉，采集于青海省大通達(dá)板山(由青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳振寧教授鑒定為Potentillafruticosa)。α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、醛糖還原酶、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(美國(guó)Sigma公司)；3,5-二硝基水楊酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)；阿卡波糖(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；依帕司他(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán))；葡萄糖測(cè)定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會(huì)社)；Alpha 1-4 LD plus冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ)；Thermo-Shaker孵育器(托赫機(jī)電科技上海有限公司)；XMARK全自動(dòng)酶標(biāo)儀(上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)。

1.3 動(dòng) 物

昆明種小鼠60只，雌雄各半，6～8周齡、體重(20±2) g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食、攝水。

2 方 法

2.1 提 取

粉碎金露梅干燥枝葉1 kg，95%甲醇回流1 h，重復(fù)3次，抽濾、合并濾液，真空濃縮[8-9]。濃縮后于等量水中分散，然后以石油醚萃取，真空干燥萃取液得石油醚萃取部位；剩余水層用乙酸乙酯萃取，萃取液真空干燥得乙酸乙酯萃取部位；剩余水層真空干燥得水層部位。另取金露梅粗粉，10倍蒸餾水浸提3次，得水浸膏，冷凍干燥得水提物。其中金露梅95%甲醇提取石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位和水層部位以及金露梅水提物的得率分別為2.41%，5.02%，4.13%和16.33%，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 金露梅提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制活性測(cè)定

2.2.1α-淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 在無(wú)抑制劑的條件下，觀察α-淀粉酶活力其隨酶量的變化關(guān)系。反應(yīng)體系設(shè)置為400 μL：在0.5 mL EP管中依次加入pH為6.0的0.05 mol/L磷酸緩沖液300 μL，淀粉溶液50 μL，不同濃度α-淀粉酶(0，0.08，0.15，0.25，0.4，0.5 mg/mL)各50 μL，搖勻后37 ℃恒溫水浴15 min。依次加入3,5-二硝基水楊酸250 μL，混勻、70 ℃水浴15 min，將反應(yīng)液置于540 nm處測(cè)定吸收度[10]。

2.2.2α-淀粉酶的抑制活性測(cè)定 按照“2.2.1”項(xiàng)方法，取pH為6.0的0.05 mol/L磷酸緩沖液250 μL，依次加入不同濃度的各提取物的待測(cè)樣品(0.039，0.078，0.156，0.313，0.625，1.25，2.5 mg/mL)各50 μL、淀粉溶液50 μL、α-淀粉酶50 μL，搖勻后37 ℃混勻并恒溫水浴15 min。依次加入3,5-二硝基水楊酸250 μL ，混勻、70 ℃水浴15 min，將反應(yīng)液置于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。

抑制劑活力單位定義：pH 6.0、37 ℃條件下每降低1個(gè)單位酶活力所需的抑制劑量。抑制率=(抑制劑活力/酶活力)×100%。各提取物對(duì)α-淀粉酶活性抑制率按公式(1)進(jìn)行計(jì)算。

(1)

式中，Α1：原有的酶活力；Α2：加入抑制劑后的酶活力；Α3：樣品背景；Α4：無(wú)3,5-二硝基水楊酸試劑背景；A5：加入3,5-二硝基水楊酸試劑后背景。

所得結(jié)果輸入SPSS 22.0進(jìn)行半數(shù)抑制濃度(IC50)的計(jì)算。

2.3 金露梅提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性測(cè)定

2.3.1α-葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 在無(wú)抑制劑的條件下，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀和不可拆96孔板測(cè)定酶的活性。反應(yīng)體系為200 μL：在pH 6.8的磷酸緩沖液150 μL和8.92 mmol/L PNPG 25 μL中分別加入不同濃度的α-葡萄糖苷酶(0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.12 U/mL) 25 μL。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行,將反應(yīng)體系置于37 ℃恒溫孵育器內(nèi)20 min，迅速在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度[11]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定 按照“2.3.1”項(xiàng)方法，測(cè)定苷酶對(duì)酶的抑制活性。反應(yīng)體系為200 μL：在磷酸緩沖液(pH 6.8) 125 μL和8.92×10-3mol/L PNPG 25 μL中分別加入不同濃度的各提取物(0.039，0.078，0.156，0.313,0.625，1.25，2.5，5 mg/mL)及不同濃度梯度的陽(yáng)性藥物阿卡波糖(0.195，0.391，0.781，1.563，3.13，6.25，12.5，25 mg/mL)各25 μL和0.05 U/mLα-葡萄糖苷酶25 μL。

為了消除測(cè)定結(jié)果中樣品和底物的影響，需測(cè)定樣品和底物的吸收度，并以磷酸緩沖液代替樣品和底物進(jìn)行校正：如公式(2)所示。

(2)

式中，Α1：原有的酶活力；Α2：加入抑制劑后的酶活力；Α3：PNPG背景；Α4：樣品背景。

所得結(jié)果輸入SPSS 22.0計(jì)算IC50。

2.4 金露梅提取物醛糖還原酶的抑制活性測(cè)定

用全自動(dòng)酶標(biāo)儀和不可拆96孔板測(cè)定酶的活性。反應(yīng)體系設(shè)為200 μL：依次加入pH 6.2的0.2 mol/L磷酸緩沖液125 μL，不同濃度各提取物(0.039，0.078，0.156，0.313，0.625，1.25，2.5 mg/mL)及相同濃度梯度的陽(yáng)性藥物依帕司他各25 μL，1.5 mmol/L NADPH 20 μL，5×10-6U/L醛糖還原酶10 μL，加入100 mmol/L DL-甘油醛20 μL啟動(dòng)反應(yīng)，以磷酸緩沖液作空白對(duì)照，25 ℃恒溫孵育器溫浴3 min后連續(xù)測(cè)定340 nm處5 min內(nèi)的吸收度，并間接測(cè)定各樣品對(duì)醛糖還原酶的抑制活性。酶活力等于反應(yīng)體系每分鐘吸收度與用磷酸緩沖液代替底物后每分鐘吸收度的差與100的乘積。

所得結(jié)果輸入SPSS 22.0計(jì)算IC50。

2.5 糖耐量測(cè)定

取正常血糖小鼠60只，按體重隨機(jī)分成6組，每組10只，雌雄各半。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食不禁水12 h后，尾靜脈采血測(cè)量小鼠空腹血糖并作記錄。分別用高、低劑量金露梅水提物(1.0、0.5 g/kg)，按照生藥量計(jì)分別為6.124、3.062 g/kg；高、低劑量金露梅乙酸乙酯部位(1.0、0.5 g/kg),按照生藥量計(jì)分別為19.92、9.96 g/kg；生理鹽水(按體重)、阿卡波糖(0.12 g/kg)給小鼠灌胃，每天1次，連續(xù)7 d，第7 d灌胃后禁食12 h，第8 d灌胃空腹測(cè)血糖后，用2.0 g/kg的淀粉給小鼠負(fù)荷劑量，在灌胃后30、60、90、120 min測(cè)量小鼠血糖并記錄。所得結(jié)果用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性差異統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié) 果

3.1 α-淀粉酶的測(cè)定結(jié)果

3.1.1α-淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線 求得α-淀粉酶回歸方程為Y=3.109X+0.1721，R2=0.993 1，吸收度在α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.08～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

3.1.2 各提取物不同濃度下對(duì)α-淀粉酶的影響 如表1所示，金露梅水提物、石油醚部位和乙酸乙酯部位的IC50分別為0.432、1.193、0.507 mg/mL。在金露梅水提物、石油醚部位和乙酸乙酯部位質(zhì)量濃度分別為0.039，0.078，0.156，0.313，0.625，1.25，2.5 mg/mL時(shí)，各個(gè)提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制率隨濃度的升高而升高，在0.039～2.5 mg/mL范圍內(nèi)，對(duì)α-淀粉酶的抑制作用具有較好的量效關(guān)系，金露梅水層部位無(wú)抑制活性。表明，金露梅水提物和乙酸乙酯部位對(duì)α-淀粉酶具有較好的抑制作用。

c/(mg/mL)Inhibition/%WEMEPMEE2.591.15±2.2861.46±2.6782.34±2.351.2586.32±2.3252.52±2.5176.15±2.140.62565.41±2.1240.12±1.9658.46±1.770.31334.33±1.9524.39±2.0137.53±1.860.15617.52±1.6713.22±1.3419.06±1.820.0787.63±0.758.76±0.6911.17±0.810.0393.22±0.422.13±0.214.02±0.45

WE：Water extract；MEP：Methanol extraction of petroleum ether；MEE：Methanol extraction of ethyl acetate

3.2 α-葡萄糖苷酶的測(cè)定結(jié)果

3.2.1α-葡萄糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線 求得α-葡萄糖苷酶曲線方程Y=0.98X+0.016，R2=0.999 4。吸收度隨α-葡萄糖苷酶量的變化而變化，α-葡萄糖苷酶質(zhì)量濃度在0.02～0.12 U/mL時(shí)與吸收度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.2.2 各提取物不同濃度下對(duì)α-葡萄糖苷酶的影響 如表2、3所示，金露梅水提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、阿卡波糖的IC50分別為0.164、0.768、0.466、2.938 mg/mL。金露梅水提物及石油醚部位、乙酸乙酯部位質(zhì)量濃度分別為0.039，0.078，0.156，0.313，0.625，1.25，2.5，5 mg/mL時(shí)，各個(gè)提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率隨濃度的升高依次升高，在質(zhì)量濃度0.039～5 mg/mL范圍內(nèi)，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，具有較好的量效關(guān)系，且金露梅水提物和乙酸乙酯部位抑制活性顯著高于阿卡波糖，水層部位無(wú)抑制活性。表明：金露梅水提物和乙酸乙酯部位對(duì)α-葡萄糖苷酶有很好的抑制作用。

c/(mg/mL)Inhibition/%WEMEPMEE599.37±2.2476.89±2.2992.37±2.642.591.75±2.8772.11±2.6889.5±2.781.2588.45±2.5462.14±2.6679.71±2.780.62579.11±2.4651.29±1.9762.52±2.610.31370.08±2.9842.2±2.8539.93±2.450.15649.06±2.3425.37±1.9916.52±2.220.07831.03±1.562.11±1.0110.59±1.980.03917.32±1.200.17±0.051.67±0.69

c/(mg/mL)Inhibition/%2579.45±1.9612.573.34±2.546.2565.22±2.023.12556.31±2.161.562 541.76±1.650.78129.55±1.280.390 617.36±1.540.195 34.55±1.23

3.3 各提取物不同濃度下對(duì)醛糖還原酶的影響

如表4所示，金露梅水提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位及依帕司他的IC50分別為0.742、2.158、1.098、0.773 mg/mL。金露梅水提物及石油醚部位、乙酸乙酯部位質(zhì)量濃度分別為0.039，0.078，0.156，0.313，0.625，1.25，2.5 mg/mL時(shí)，各提取物對(duì)醛糖還原酶的抑制率隨質(zhì)量濃度的升高依次升高，在質(zhì)量濃度0.039～2.5 mg/mL范圍內(nèi)，對(duì)醛糖還原酶的抑制作用呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，金露梅水提物抑制率高于依帕司他，水層部位無(wú)抑制活性。說(shuō)明金露梅水提物對(duì)醛糖還原酶有很好的抑制作用。

c/(mg/mL)Inhibition/%WEMEPMEEEpalrestat2.565.44±2.7446.23±1.8760.33±2.0367.29±2.171.2559.32±2.2242.22±2.6953.24±1.9262.43±2.280.62552.43±1.5932.78±1.4745.25±1.0253.76±0.990.312 543.56±1.9519.65±1.2732.89±1.8537.11±1.650.156 2524.19±1.6511.32±1.289.98±1.8713.14±2.080.078 134.09±1.032.14±1.211.67±1.265.25±0.98

3.4 金露梅提取物對(duì)小鼠餐后血糖的影響

如表5所示，各給藥組與空白組對(duì)比，金露梅水提物和乙酸乙酯部位的高、低劑量組均能降低小鼠餐后血糖。金露梅水提物和乙酸乙酯部位高劑量組在給藥30、90、120 min后，能降低用淀粉負(fù)荷后小鼠的血糖水平(P<0.05)，差異顯著；金露梅水提物和乙酸乙酯部位高劑量組在給藥60 min后，能明顯降低用淀粉負(fù)荷后小鼠的血糖水平(P<0.01)，差異極顯著；金露梅水提物和乙酸乙酯部位低劑量組在給藥30、60 min后，能降低用淀粉負(fù)荷后小鼠的血糖水平(P<0.05)。

GroupDose/(g/kg)Blood glucose/(mmol/L)Overnight fasting30 min60 min90 min120 minControl-5.77±0.778.17±1.099.13±0.838.18±0.717.72±1.32Acarbose0.125.07±1.286.28±1.21*7.08±1.47*6.58±1.355.95±1.18*WE1.05.35±0.846.25±0.99*6.52±1.01**6.45±1.34*5.58±1.14*0.54.88±1.356.57±0.67*7.15±1.26*7.25±1.456.13±1.05MEE1.05.48±0.696.28±0.93*6.93±0.86**6.48±0.92*5.38±0.71*0.55.18±0.936.65±1.06*7.22±1.23*7.28±0.896.33±0.78

*P<0.05;**P<0.01vscontrol group

4 討 論

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是催化水解碳水化合物過(guò)程中重要的酶。醛糖還原酶能將葡萄糖催化還原為山梨醇，還可催化還原脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生醛及其衍生物，繼而在糖代謝多元醇通路中起限速作用。因此，這幾類酶的抑制劑可以有效對(duì)抗2型糖尿病及其并發(fā)癥[11-14]。

本研究通過(guò)金露梅不同提取物對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和醛糖還原酶的抑制作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)金露梅水提物對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和醛糖還原酶的抑制作用大于乙酸乙酯萃取部位，石油醚萃取部位對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和醛糖還原酶的抑制作用最弱。

體外篩選結(jié)果顯示，金露梅水提物、95%甲醇提取乙酸乙酯萃取部位對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和醛糖還原酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用，水層部位無(wú)抑制活性。結(jié)果表明，金露梅對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和醛糖還原酶均有不同程度的抑制作用。小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金露梅提取物具有一定的降低餐后血糖的作用。

目前為止，被發(fā)現(xiàn)有降血糖功能的委陵菜屬植物包括翻白草(PotentilladiscolorBunge.)、朝天委陵菜(PotentillasupinaLinn.)、蛇含委陵菜(PotentillakleinianaWight et Arn.)[7]等，但對(duì)金露梅的降血糖作用研究甚少。本研究通過(guò)體外篩選金露梅的α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和醛糖還原酶的抑制活性作用，體內(nèi)對(duì)其進(jìn)行降血糖作用的研究，為金露梅植物的降血糖功能提供依據(jù)，同時(shí)也為金露梅后續(xù)開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。