盛雪萍，趙夢鴿，蔣翠花，張 健，殷志琦

(1中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥制劑系&天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；2江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京 210028)

糖尿病是一種多病因的代謝類疾病，可引發(fā)多種并發(fā)癥，如糖尿病腎病、糖尿病足、糖尿病酮癥酸中毒等[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，2014年全球有4.22億人患有糖尿病，18歲以上成人糖尿病患病率從1980年的4.7%增加到2014年的8.5%[2]。目前糖尿病治療的首選方案是在生活方式干預(yù)基礎(chǔ)上，給予二甲雙胍、磺脲類、DPP-4抑制劑、SGLT2抑制劑等藥物[3]，但許多糖尿病患者接受治療后血糖控制不理想[4]。現(xiàn)有的糖尿病治療藥物作用機(jī)制或靶點(diǎn)相對單一，易產(chǎn)生耐藥性，部分藥物(如磺脲類)存在一定心血管損傷，限制了其使用[5-6]。天然藥物治療糖尿病具有低毒、多成分、多靶點(diǎn)的整體協(xié)同作用優(yōu)勢，利用天然藥物設(shè)計(jì)新的降糖藥物或組方藥物能改善糖尿病患者多種臨床癥狀，達(dá)到降糖或輔助降糖的功效[7-9]。

青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk]為胡桃科青錢柳屬植物，傳統(tǒng)作為茶葉飲用，被譽(yù)為降糖神茶，于2013年被列入新資源食品目錄[10]。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)青錢柳可改善胰島素抵抗，顯著降低血糖[11-12]。桑葉是?？浦参锷?MorusalbaL.)的干燥葉，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為藥食兩用食材，桑葉可抑制血糖上升，促進(jìn)胰島素分泌，保護(hù)胰島細(xì)胞，發(fā)揮降血糖功效[13-15]。已有文獻(xiàn)證實(shí)，在糖尿病發(fā)生發(fā)展中往往同時(shí)具有胰島素抵抗和胰島受損而胰島素分泌不足的特征[16]。因此將青錢柳和桑葉配伍組方，既能改善胰島素抵抗，又能促進(jìn)胰島素分泌，發(fā)揮協(xié)同作用降低血糖。本研究通過誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型，檢測血糖、血脂、胰島素、糖耐量以及肝腎指標(biāo)，評價(jià)青錢柳和桑葉組方藥物的降血糖效果和安全性。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

四氧嘧啶[ALX,阿拉丁試劑(上海)有限公司]；葡萄糖粉劑(江西紅星藥業(yè)有限公司)；鹽酸二甲雙胍腸溶片(北京利齡恒泰藥業(yè)有限公司)；胰島素試劑盒購自(南京建成生物工程研究所)；血糖試紙(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)。

1.2 儀 器

酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio Tek公司)；超速控溫離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；全自動分析儀Cobas 8000[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]；血糖儀HGM-114(蘇州爾達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

1.3 動 物

所選實(shí)驗(yàn)動物為成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK(蘇)2014-0001，飼養(yǎng)環(huán)境SPF級。

1.4 動物飼料

TP0850高熱能飼料(豬油10%、蔗糖15%、蛋黃粉15%、酪蛋白5%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、碳酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、鼠維持料52.6%)以及LAD0011標(biāo)準(zhǔn)飼料購自南通特洛菲科技有限公司。

1.5 藥物制備

青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk]來源為溧陽青錢柳，桑(MorusalbaL.)來源為安徽石臺桑葉。取青錢柳干燥葉1 kg，粉碎，以水15 L 70 ℃提取1 h，過濾，濃縮干燥得青錢柳水提物114 g (出膏率為11.41%)；同法制備桑葉水提物231 g (出膏率為23.14%)。所得提取物分別用蒸餾水溶解，貯存于-4 ℃冰箱備用。

2 方 法

2.1 造模及給藥方式

參考國家食品藥品監(jiān)督管理局以國食藥監(jiān)?；?012〕107號印發(fā)《輔助降血糖功能評價(jià)方法》中方案二構(gòu)建四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型[17]。

SD大鼠適應(yīng)5 d后，稱重，按體重將大鼠隨機(jī)分成8組?？瞻捉M(Blank)不做處理；模型組(Model)給予同體積蒸餾水；陽性藥組(Met)給予二甲雙胍[150 mg/(kg·d)]；青錢柳組(CP)給予青錢柳水提物，桑葉組(ML)給予桑葉水提物；青錢柳葉和桑葉組方藥物組CM1、CM2、CM3分別給予青錢枊葉和桑葉3∶1、1∶1、1∶3混合物。本實(shí)驗(yàn)中給藥劑量均以生藥量計(jì)算，待測藥物組給藥劑量為1 g/(kg·d)，連續(xù)給藥33 d?？瞻捉M持續(xù)以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，其他組標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)1周后更換飼料，以高熱能飼料喂養(yǎng)3周后，禁食24 h(不禁水)，腹腔注射ALX 105 mg/kg(1 mL/100 g)，注射后繼續(xù)給予高熱能飼料喂飼5 d。記錄SD大鼠每周體重變化。

2.2 生化指標(biāo)檢測

給藥第33天，進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(2.5 g/kg)，分別在0、0.5、2 h測定其血糖并計(jì)算血糖曲線下面積AUC。試驗(yàn)結(jié)束后，隔天禁食12 h，檢測計(jì)算體重、空腹血糖(FBG)、糖耐量(OGTT)、血清胰島素(Ins)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、血脂指標(biāo)[總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)]和肝腎指標(biāo)[谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、尿酸(UA)]。取胰腺組織和肝臟組織樣本，做組織切片，HE染色后觀察并拍照。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié) 果

3.1 青桑組方對大鼠體重的影響

如表1所示，第3周開始，模型組體重比空白組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。第4周開始，CP組與模型組相比體重明顯較高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，CP、CM1組相比其他組體重偏高，ML、CM2、CM3組體重較模型組呈下降趨勢。

GroupWeight/g1st week2nd week3rd week 4th week5th weekBlank266.47±21.56295.29±35.87284.64±35.04279.08±34.54291.92±33.72Model262.87±25.42305.47±28.23326.20±33.13**331.71±49.62**335.21±41.98**Met264.27±22.53300.53±39.05314.13±40.80341.43±52.80321.00±36.31CP269.07±22.64316.79±17.57342.43±29.27371.64±42.28#378.00±44.81#ML257.36±25.26298.38±25.05302.93±31.73311.08±33.01323.60±39.54CM1258.60±19.24307.07±30.48324.93±46.04348.42±41.13353.18±44.05CM2262.33±24.24315.67±35.88327.60±47.09320.92±31.65311.13±38.15CM3259.20±16.75310.67±34.20327.53±46.05335.20±47.04323.56±52.05

Met:Metformin (150 mg/(kg·d));CP:Water extract ofC.paliurus,1 g/(kg·d);ML:Water extract of Mulberry leaves,1 g/(kg·d);CM1-CM3:the extract mixture ofC.paliurusand Mulberry leaves with the ratio as 3∶1,1∶1 and 1∶3

**P<0.01vsblank group;#P<0.05vsmodel group

3.2 青桑組方對大鼠FBG和血脂的影響

從FBG指標(biāo)(表2)來看，模型組的FBG水平比空白組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型成立。與模型組相比，Met、CP、ML組的FBG分別下降20.54%、20.18%、2.18%；CM1、CM2、CM3組較模型組的FBG分別下降了21.64%、16%、12.55%，CM1組與CP組SD大鼠FBG均顯著改善(P<0.05)，二者差異不明顯。

從血脂指標(biāo)來看，模型組與空白組相比，TC、LDL-C顯著性升高(P<0.01)，TG、HDL-C無顯著性差異，模型成立。ML組、CM3組的TC、LDL-C值相比模型組顯著性下降(P<0.05)，其中ML組TC、LDL-C分別下降17.90%和27.48%，CM3組TC、LDL-C分別下降19.65%和20.45%；其他藥物組對血脂指標(biāo)無明顯影響。

3.3 青桑組方對大鼠糖耐量的影響

模型組與空白組相比，0 h、0.5 h、2 h血糖以及AUC均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且0.5 h時(shí)模型組血糖大于10 mmol/L，判定模型成立(表3)。與模型組相比,Met、CP、CM1組0 h血糖顯著性降低(P<0.05)，0.5 h時(shí)各藥物組與模型組相比血糖均下降，Met、ML、CM1組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，除CM3組外其余藥物組2 h血糖相比模型組均顯著性下降(P<0.05)。Met、CP、ML、CM1組AUC與模型組相比顯著下降(P<0.05)，CM2、CM3組有下降趨勢。

GroupFBG/(mmol/L)TC/(mmol/L)TG/(mmol/L)HDL-C/(mmol/L)LDL-C/(mmol/L)Blank4.25±0.782.29±0.350.55±0.112.04±0.290.60±0.14Model5.50±0.86**4.58±0.51**0.67±0.121.75±0.173.13±0.46**Met4.37±0.70#4.41±0.530.71±0.182.23±0.492.77±0.69CP4.39±0.73#4.46±1.190.59±0.221.75±0.483.22±0.691ML5.38±0.863.76±0.92#0.55±0.211.82±0.412.27±0.84#CM14.31±0.83#4.16±1.090.59±0.201.85±0.292.79±0.87CM24.81±0.794.12±0.430.54±0.181.87±0.302.76±0.61CM34.62±1.013.68±0.70#0.58±0.101.82±0.132.49±0.48#

**P<0.01vsblank group;#P<0.05vsmodel group

Group Glucose/(mmol/L)0 h(mmol/L)0.5 h(mmol/L)2 h(mmol/L)AUC/(h·mmol/L)Blank4.39±0.637.29±1.034.29±0.7511.60±1.01Model5.71±0.83**14.45±3.91**8.25±2.38**22.07±5.04**Met4.73±0.64#8.45±1.75##5.00±0.71##13.38±2.06##CP4.75±0.70#10.84±3.025.05±1.06##15.81±3.01##ML5.21±0.569.84±3.26#5.46±1.67#15.24±4.34#CM14.75±0.95#9.88±2.54#5.11±0.95##14.90±2.25##CM25.09±0.6911.89±3.306.01±1.20#17.67±3.54CM34.86±1.1813.01±3.276.26±1.7918.93±4.33

*P<0.05,**P<0.01vsblank group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3.4 青桑組方對大鼠胰島素和胰腺組織的影響

3.4.1 青桑組方對大鼠血清胰島素和胰島素抵抗指數(shù)的影響 如表4所示，各組間大鼠胰島素含量無明顯差異，Met組和ML組大鼠胰島素含量較高，與空白組相近。模型組與空白組相比，胰島素抵抗指數(shù)升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而Met、CP、CM1組與模型組相比，胰島素抵抗指數(shù)顯著性降低(P<0.05)。

Group Ins/(mIU/L)HOMA-IRBlank38.56±4.067.06±1.92Model36.22±2.638.87±1.52Met38.06±4.527.32±0.90#CP36.06±4.436.86±1.54#ML38.93±6.239.35±2.19CM137.60±4.317.08±1.32#CM237.50±1.938.01±1.20CM337.04±2.987.56±1.40

#P<0.05vsmodel group

3.4.2 青桑組方對大鼠胰腺組織的影響 圖1為SD大鼠胰腺組織HE染色結(jié)果?？瞻捉M大鼠胰腺組織中胰島數(shù)量較多，呈團(tuán)索狀，邊界清晰，細(xì)胞排列整齊。模型組大鼠胰島體積變小，結(jié)構(gòu)破壞，邊界不清晰，胰島內(nèi)細(xì)胞排列雜亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，有空泡，邊緣有淋巴細(xì)胞浸潤，呈現(xiàn)出胰島受損的狀態(tài)。與模型組相比，各給藥組均有不同程度的改善胰島受損的現(xiàn)象。Met組和CP組的胰島細(xì)胞排列整齊，胰島體積有所增大，但胰島內(nèi)仍然存在空泡和少量炎性細(xì)胞；ML、CM1、CM2、CM3組的胰島結(jié)構(gòu)相對完整，邊界清晰，胰島內(nèi)無明顯空泡，無淋巴細(xì)胞浸潤，其中ML和CM1組胰島組織狀態(tài)基本接近空白組。

3.5 青桑組方對大鼠肝腎功能的影響

3.5.1 青桑組方對大鼠肝腎功能指標(biāo)的影響 如表5所示，模型組大鼠血清中ALT、AST與空白組相比略有升高，但無顯著性差異；各藥物組干預(yù)效果不同，其中CP、ML、CM1組肝功能指標(biāo)與模型組相比顯著下降，其他各組有下降趨勢，但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

腎功能指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，模型組與空白組相比BUN、CRE均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明模型組大鼠的腎功能受損。除Met組外，其他藥物組BUN值與模型組相比均顯著性降低，ML組、CM1組、CM2組CRE值與模型組相比顯著性降低(P<0.05)。以上結(jié)果提示青錢柳和桑葉可能對高脂飼料和四氧嘧啶誘導(dǎo)的腎功能損傷有改善作用。

Figure1 Effects of the extract mixture ofC.paliurusand Mulberry leaves on pancreatic tissue in SD rats the arrows are indicated as pancreatic islet tissue (HE,×400)

A:Blank;B:Model;C:Met;D:CP;E:ML;F:CM1 (CP-ML,3∶1);G:CM2 (CP-ML,1∶1);H:CM3 (CP-ML,1∶3)

GroupALT/(U/L)AST/(U/L)BUN/(mmol/L)CRE/(μmol/L)UA/(μmol/L)Blank42.75±8.94218.88±46.746.80±1.4935.38±5.53234.75±41.85Model46.25±9.72244.25±46.0910.15±2.47**46.38±5.13**285.13±68.43Met41.13±9.60185.75±25.78##8.91±1.8351.13±4.85231.75±68.38CP34.75±6.11#164.38±28.05##7.72±1.47#48.75±7.70260.13±62.99ML33.00±4.90##139.50±48.81##6.90±0.82##39.50±3.16##263.75±63.42CM132.50±8.43##182.00±42.52#7.46±1.44#40.38±4.63#234.00±59.94CM240.50±10.03223.38±52.747.62±1.65#39.00±8.16#225.38±44.91CM343.13±14.56211.50±52.857.47±1.94#43.75±7.34295.13±71.80

**P<0.01vsblank group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3.5.2 青桑組方對大鼠肝組織的影響 如圖2所示，空白組大鼠的肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)完整，以中央靜脈為中心，肝索呈輻射狀排列，肝細(xì)胞形態(tài)正常，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)明顯受損，肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡，并有少許炎性細(xì)胞浸潤。相比模型組，藥物組均不同程度的改善大鼠肝組織損傷，其中CM1組呈現(xiàn)為脂肪空泡明顯減少，肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉和肝索結(jié)構(gòu)較完整清晰，最接近空白組大鼠肝組織形態(tài)，相比其他藥物組，CM1對于肝組織的保護(hù)效果較為顯著。

Figure2 Effects of the extract mixture ofC.paliurusand Mulberry leaves on liver tissue in SD rats the arrows are indicated as fatty air bubbles of liver (HE,×400)

A:Blank;B:Model;C:Met;D:CP;E:ML;F:CM1 (CP-ML,3∶1);G:CM2 (CP-ML,1∶1);H:CM3 (CP-ML,1∶3)

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)以高熱能飼料聯(lián)合小劑量四氧嘧啶造模，模型組大鼠體重和FBG顯著升高，糖耐量異常，胰島受損，成功誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性糖尿病。與模型組相比，Met、CP、CM1組FBG指標(biāo)顯著性下降，Met、CP、ML、CM1、CM2組大鼠糖耐量明顯改善，胰島組織損傷減輕，各藥物組肝腎組織均無明顯損傷，表明青錢柳和桑葉組方后能夠安全有效地控制血糖水平。

胰島素抵抗和部分胰腺β細(xì)胞功能障礙是2型糖尿病的主要發(fā)病原因[18]。Pan等[19]發(fā)現(xiàn)青錢柳水提物可增加IR-HepG2細(xì)胞的糖消耗，改善胰島素抵抗。本試驗(yàn)中青錢柳組胰島素抵抗指數(shù)、空腹血糖和AUC顯著降低，表明青錢柳水提物可能通過增加胰島素敏感性發(fā)揮降血糖作用。胰腺β細(xì)胞功能障礙早期表現(xiàn)為胰島素Ⅰ相分泌不足，造成餐后高血糖，引起氧化應(yīng)激，損傷血管內(nèi)皮，易導(dǎo)致心血管疾病[20]。Xu等[21]研究對比桑葉不同提取物的降血糖活性，發(fā)現(xiàn)其總多糖成分功效最顯著。桑葉多糖還能促進(jìn)四氧嘧啶糖尿病小鼠胰島素分泌，改善其糖耐量，從而降低血糖[22]。本研究結(jié)果顯示桑葉組胰島素分泌量增加，且胰島結(jié)構(gòu)的完整性良好，糖耐量實(shí)驗(yàn)中0.5和2 h降低血糖效果顯著，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。綜上所述，青錢柳和桑葉組方后協(xié)同發(fā)揮降糖作用，不僅能降低空腹血糖，還能降低餐后血糖，可更好控制血糖水平。糖尿病與肥胖和高血脂癥密切相關(guān)，降低血脂和體重有助于控制糖尿病病情的發(fā)展[23]。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)桑葉可以顯著抑制腸道內(nèi)膽固醇的吸收，降低血液黏度，從而發(fā)揮降低血脂作用[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CP組大鼠血脂及體重控制不理想，而ML、CM3組的TC、LDL-C顯著下降，說明其控制血脂效果較好，可見青錢柳和桑葉組方后更有益于糖尿病患者血脂水平的調(diào)控。

糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病引起的危害性最大的一種慢性并發(fā)癥。腎功能受損時(shí)，二甲雙胍等降糖藥物的藥代動力學(xué)發(fā)生改變，易導(dǎo)致低血糖或乳酸酸中毒等不良反應(yīng)，其治療具有局限性[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青錢柳和桑葉及其組方均能改善腎功能指標(biāo)Cre、BUN，緩解腎損傷。此外，王曉紅等[26]研究發(fā)現(xiàn)青錢柳水提物能夠減少糖尿病腎病大鼠的尿蛋白排泄量，保護(hù)腎功能，減輕腎臟的負(fù)荷。陳建清等[27]發(fā)現(xiàn)桑葉多糖顯著降低尿微量白蛋白含量、尿量及血清中Cre、BUN，緩解腎臟組織損傷。由此可見，青錢柳和桑葉組方后可以作為Met等降糖藥物的輔助治療藥物，預(yù)防和改善糖尿病腎病。

綜上所述，與單用青錢柳組(CP)相比，青錢柳和桑葉配伍組方的CM1組降低空腹血糖的效果與CP組相近，CM1組的胰島組織狀態(tài)明顯優(yōu)于CP組；與單用桑葉組(ML)相比，組方藥物降血糖的效果更加明顯，其中CM3組還具有與桑葉組類似的降血脂效果。由此可見，青錢柳和桑葉組方后具有更好的降糖效果，并且安全性高，適合作為輔助降血糖產(chǎn)品進(jìn)行開發(fā)利用，但其優(yōu)勢配比需要進(jìn)一步優(yōu)選，且其降糖物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。