宮俐 韓中波

（吉林市結(jié)核病防治研究所 吉林 吉林 132011）

Xpert Mtb/RIF技術(shù)使用半定量巢氏熒光PCR，該技術(shù)針對(duì)結(jié)核桿菌利福平耐藥基因rpoB基因區(qū)設(shè)定引物、探針，擴(kuò)增熒光檢測(cè)，其是否發(fā)生基因突變，檢測(cè)標(biāo)本中是否含有結(jié)核桿菌及是否對(duì)利福平耐藥，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程需3小時(shí)左右。線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測(cè)技術(shù)直接從臨床收集的病人肺部涂片陽(yáng)性痰標(biāo)本中提取核酸DNA、用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增和反向雜交。通過(guò)檢測(cè)rpoB基因突變（編碼RNA聚合酶β-亞單位）確定對(duì)利福平的耐藥性；通過(guò)檢測(cè)katG基因（編碼過(guò)氧化氫酶）和inhA基因的啟動(dòng)子區(qū)（編碼NADH烯酰酸性磷酸酶還原酶）確定對(duì)異煙肼的耐藥性。從而，對(duì)來(lái)自培養(yǎng)物或病人肺部涂片陽(yáng)性痰標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及其耐利福平和/或異煙肼耐藥基因進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.資料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

2015年10月至2018年6月期間吉林市結(jié)核病防治研究所及所轄各縣區(qū)結(jié)防所收治的疑似結(jié)核病患者共1345份痰標(biāo)本。

1.2 檢測(cè)方法

對(duì)1345份痰標(biāo)本進(jìn)行熒光染色涂片鏡檢檢測(cè)、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、結(jié)核桿菌比例法藥敏，相關(guān)操作及結(jié)果判定。其操作均按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

臨床確診肺結(jié)核病442例，對(duì)442例患者痰標(biāo)本進(jìn)行Xpert Mtb/RIF檢測(cè)和線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測(cè)，其操作均按試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

2.結(jié)果

2.1 1345例初診肺結(jié)核可疑患者，經(jīng)X線、CT、實(shí)驗(yàn)室檢查，臨床最終確診肺結(jié)核病442例，確診率為32.9%。

2.2 Xpert Mtb/RIF檢測(cè)及線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測(cè)結(jié)核桿菌應(yīng)用價(jià)值的評(píng)價(jià)

對(duì)442例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本進(jìn)行涂片鏡檢，改良羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率分別為24.4%（108/442）、42.3%（187/442），對(duì)442例肺結(jié)核病人痰標(biāo)本進(jìn)行Xpert Mtb/RIF檢測(cè)、線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測(cè)陽(yáng)性率分別為49.5%（219/442）、44.8%（198/442）。Xpert Mtb/RIF檢測(cè)陽(yáng)性率略高線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測(cè)，兩種分子生物學(xué)方法檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于涂片鏡檢，改良羅氏培養(yǎng)法。

2.3 Xpert Mtb/RIF檢測(cè)利福平耐藥

Xpert Mtb/RIF檢測(cè)結(jié)果報(bào)告時(shí)間只需2～3小時(shí)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于培養(yǎng)（2個(gè)月）、培養(yǎng)藥敏（3個(gè)月）的報(bào)告時(shí)間。Xpert Mtb/RIF檢測(cè)利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為90.2%、特異性為97.0%。見表1。

表1 Xpert Mtb/RIF檢測(cè)利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較

2.4 線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測(cè)利福平、異煙肼耐藥

檢測(cè)結(jié)果報(bào)告時(shí)間需2～3天，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于培養(yǎng)（2個(gè)月）、培養(yǎng)藥敏（3個(gè)月）的報(bào)告時(shí)間。線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測(cè)利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為88.0%、特異性為95.4%。檢測(cè)異煙肼耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為73.7%、特異性為90.3%。見表2。

表2 線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測(cè)利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較

3.討論

近年來(lái)，Xpert Mtb/RIF檢測(cè)系統(tǒng)逐漸在基層推廣使用、線性探針雜交技術(shù)（Hain）在具有條件地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室推廣，本文對(duì)Xpert Mtb/RIF檢測(cè)技術(shù)、線性探針雜交技術(shù)（Hain）在檢測(cè)臨床標(biāo)本診斷結(jié)核病及利福平、異煙肼耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)。

Xpert Mtb/RIF核酸檢測(cè)采用美國(guó)公司GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)，是一種半巢式實(shí)時(shí)定量熒光PCR體外擴(kuò)增技術(shù)，針對(duì)利福平耐藥rpoB基因81bp核心區(qū)間（RRDR）設(shè)計(jì)相關(guān)引物、核酸探針，檢測(cè)相關(guān)基因是否發(fā)生突變，進(jìn)而診斷是否結(jié)核桿菌感染以及是否對(duì)利福平耐藥。本研究Xpert Mtb/RIF檢測(cè)陽(yáng)性率為49.5%，高于涂片鏡檢、結(jié)核桿菌培養(yǎng)法的陽(yáng)性檢出率，且時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于培養(yǎng)（6～8周）。Xpert Mtb/RIF檢測(cè)利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為90.2%、特異性為97.0%。表明Xpert Mtb/RIF技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌具較高有的臨床應(yīng)用價(jià)值，可以對(duì)肺結(jié)核的診斷及合理規(guī)范治療起到重要作用。線性探針雜交技術(shù)（Hain），從培養(yǎng)物或直接從臨床收集的病人痰標(biāo)本中提取核酸DNA、用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增和反向雜交。雜交包括下列步驟：擴(kuò)增產(chǎn)物的變性，單鏈雜交、生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與膜上的探針雜結(jié)合、嚴(yán)格漂洗、與鏈霉親和素/堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記物孵育、堿性磷酸酶介導(dǎo)的顯色反應(yīng)，判讀模板，便于對(duì)所獲帶型簡(jiǎn)易、快速做出解釋。實(shí)驗(yàn)只需3天時(shí)間，即可檢測(cè)出結(jié)核桿菌及利福平和異煙肼是否耐藥。線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測(cè)結(jié)核分支桿菌陽(yáng)性率為44.8%，線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測(cè)利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為88.0%、特異性為95.4%。檢測(cè)異煙肼耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為73.7%、特異性為90.3%。

Xpert Mtb/RIF檢測(cè)技術(shù)、線性探針雜交技術(shù)（Hain）均是世衛(wèi)組織認(rèn)可的結(jié)核病快速檢測(cè)新方法，Xpert Mtb/RIF檢測(cè)技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快捷，只需3小時(shí)左右即可得到報(bào)告；生物安全要求低，具備生物安全柜就可操作，具有較高的陽(yáng)性檢出率，Xpert Mtb/RIF檢測(cè)利福平耐藥與傳統(tǒng)比例法藥敏進(jìn)行比較，敏感性和特異性均較高，在基層結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)具有較高的應(yīng)用價(jià)值。研究表明，線性探針雜交技術(shù)（Hain）可快速、準(zhǔn)確鑒定結(jié)核分枝桿菌并對(duì)利福平、異煙肼耐藥基因進(jìn)行檢測(cè),適用于檢測(cè)結(jié)核菌株和痰標(biāo)本，可大幅縮短藥物敏感試驗(yàn)時(shí)間,有利于指導(dǎo)臨床用藥治療。但該技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室有嚴(yán)格要求，需要在通過(guò)認(rèn)證的PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)，更適合在市級(jí)結(jié)核病PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行推廣。