顧金霞 張振新 黃華

（1南通市中醫(yī)院耳鼻咽喉科 江蘇 南通 226001）

（2南通大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科 江蘇 南通 226001）

（3南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科 江蘇 南通 226001）

缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）作為目前唯一一個(gè)已發(fā)現(xiàn)的在特異性缺氧狀態(tài)下，能夠發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子。CD105是一種在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，參與腫瘤新生血管生成的相關(guān)蛋白。本研究運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)50例喉鱗癌標(biāo)本中的HIF-1α和CD105的表達(dá)水平，探究?jī)梢蜃釉诤戆┗颊邫C(jī)體中的表達(dá)關(guān)系及其對(duì)該疾病產(chǎn)生的影響。

1.資料與方法

1.1 一般資料

本研究所用病例來(lái)自南通大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科2002～2009年間喉癌術(shù)后石蠟標(biāo)本（術(shù)后病理診斷為鱗狀細(xì)胞癌）且臨床資料齊備者50例，所有患者在術(shù)前均未行放、化療治療?；颊吣挲g32～78歲，平均年齡61歲，其中男性49例，女性1例。喉癌按照2002年AJCC/UICC（美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)/國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)）制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期T1N0M0 8例；T2N0M0 27例；T2N2M0 1例；T3N0M0 9例；T3N1M0 4例；T3N2 M0 1例。組織學(xué)分型為：高分化22例，中分化25例，低分化3例。其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者6例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者44例。另取10例癌旁組織作對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 試劑 鼠抗人HIF-1α、CD105單克隆抗體及試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組化SP檢測(cè) 每例標(biāo)本分為兩份，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)HIF-1α和CD105的表達(dá)。由試劑公司提供陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。DAB顯色切片結(jié)果用彩色病理圖像分析系統(tǒng)采集。

1.2.3 結(jié)果判斷 所有切片均采取雙盲法由兩位病理醫(yī)師觀察診斷。

（1）參照Aebersold等[1]的方法對(duì)HIF-1α結(jié)果結(jié)果進(jìn)行判定，陽(yáng)性結(jié)果表現(xiàn)為細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)，出現(xiàn)棕黃色顆粒，綜合染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比采用半定量處理，具體標(biāo)準(zhǔn)為：未見(jiàn)陽(yáng)性染色記0分；陽(yáng)性細(xì)胞比例≤1%記1分；陽(yáng)性細(xì)胞比例占其1%～10%且呈或輕、中度染色，或陽(yáng)性細(xì)胞比例占10%～50%，且呈輕度染色記2分；陽(yáng)性細(xì)胞比例占10%～50%且呈中、強(qiáng)度染色記3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例＞50%且呈中、強(qiáng)度染色記4分。其中：0～2分為低表達(dá)，3～4分為高表達(dá)。

（2）參照Weidner[2]微血管計(jì)數(shù)方法，CD105陽(yáng)性表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿呈棕黃色。且全部染色為棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇，均作為一個(gè)微血管計(jì)數(shù)。首先在100鏡下，尋找瘤內(nèi)微血管較為密集的區(qū)域，然后調(diào)至400倍鏡，并對(duì)其中的微血管數(shù)目進(jìn)行記錄，共觀察5個(gè)高倍視野，其微血管數(shù)（MVD）為各視野數(shù)據(jù)的平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS13.0軟件包處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

HIF-1α陽(yáng)性染色主要定位于腫瘤細(xì)胞胞漿，表現(xiàn)為陽(yáng)性細(xì)胞成團(tuán)分布。HIF-1α蛋白在鱗狀細(xì)胞癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為86.00%（43/50），其中低表達(dá)52.00%（26/50），高表達(dá)48.00%（24/50）。正常對(duì)照組中10例僅1例表達(dá)，陽(yáng)性率10%。兩者間比較有顯著差異（P＜0.01）。CD105主要在表達(dá)于喉鱗癌組織的微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中，大血管染色不明顯，染色呈現(xiàn)濃重的棕色。50例喉癌標(biāo)本中，CD105標(biāo)記的微血管密度（MVD）平均值是15.0±3.78，在對(duì)照組中未有表達(dá)，比較有顯著差異（P＜0.01）。

HIF-1α在病理分級(jí)中以中分化組表達(dá)率高，差異顯著（P＜0.05），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期無(wú)顯著差異（P＞0.05）。CD105在喉癌侵犯程度高（T3期）表達(dá)率高，差異顯著（P＜0.05），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)無(wú)顯著差異（P＞0.05）（表1）。

表1 HIF-1α、CD105與喉鱗癌臨床病理特征間的關(guān)系

在喉鱗癌組織中，HIF-1α表達(dá)強(qiáng)度與CD105-MVD表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）HIF-1α表達(dá)強(qiáng)度與CD105-MVD表達(dá)（表2）。

表2 HIF-1α蛋白的表達(dá)與CD105-MVD的關(guān)系

3.討論

腫瘤細(xì)胞逐漸適應(yīng)缺氧適應(yīng)及其血管生成，使其發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵步驟。本研究顯示HIF-1α在病理分級(jí)中以中分化組表達(dá)率高，差異具顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HIF-1α在喉鱗癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。與對(duì)照組相比，HIF-1α在喉鱗癌組織中表達(dá)具有顯著性，這一結(jié)果在其他腫瘤組織中表達(dá)類(lèi)似，表明細(xì)胞缺氧情況在惡性腫瘤的發(fā)展中較為普遍。而其血管生成的數(shù)量主要可通過(guò)對(duì)微血管密度（MVD）進(jìn)行檢測(cè)來(lái)評(píng)估[3]。本研究表明CD105在正常喉粘膜血管上不表達(dá)，與喉鱗癌組織中表達(dá)有顯著差異提示CD105強(qiáng)表達(dá)于高度增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞，因而被認(rèn)為是新生血管的標(biāo)志[4]。本研究顯示CD105在喉癌侵犯程度高（T3期）表達(dá)率高，組間差異具顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，一定程度上表明了CD105在喉鱗癌發(fā)生、浸潤(rùn)過(guò)程中有著重要作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究結(jié)直腸癌中HIF-1α的表達(dá)情況得出HIF-1α的表達(dá)與MVD相關(guān)。目前在喉鱗癌中HIF-1α和腫瘤血管生成的關(guān)系的研究較少，而用CD105標(biāo)記喉鱗癌的微血管密度就更為少見(jiàn)。本研究顯示HIF-1α蛋白在喉鱗癌組織中的高表達(dá)與CD105的表達(dá)呈正相關(guān)。兩者在喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展中可能起協(xié)同作用。未來(lái)需進(jìn)一步研究HIF-1α和CD105在分子水平乃至基因水平的調(diào)控機(jī)制與關(guān)聯(lián)。如能在喉癌發(fā)生過(guò)程中進(jìn)一步探明兩因子之間的調(diào)控機(jī)制與關(guān)聯(lián)，則針對(duì)HIF-1α和CD105的靶向治療將成為喉癌綜合治療的新亮點(diǎn)。