王根杰，李德美，張亞?wèn)|，辛聞，王宗義

(北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，102206)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，簡(jiǎn)稱EC)，是大多數(shù)發(fā)酵食品(如面包、牛奶等)和酒精飲料(啤酒、白酒、葡萄酒等)生產(chǎn)及貯存過(guò)程中產(chǎn)生的一種天然副產(chǎn)物[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，EC在生物體內(nèi)代謝時(shí)，被細(xì)胞色素P-450酶(cytochrome P-450，簡(jiǎn)稱CYP)催化生成N-羥基-氨基-甲酸乙酯，后者誘導(dǎo)Cu2+調(diào)控的DNA損傷，引起DNA的氧化和脫嘌呤反應(yīng)，使基因缺失或突變，這是EC致癌的主要原因[2-4]。2007年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將EC的致癌級(jí)別由之前的2B類提升認(rèn)定為2A類。一些主要葡萄酒生產(chǎn)國(guó)也相繼制定了本國(guó)的葡萄酒中EC含量的限定標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)葡萄餐酒中的EC限量為15 μg/L，加拿大、韓國(guó)和捷克生產(chǎn)葡萄酒中的EC限量為30 μg/L。目前，我國(guó)仍未制定葡萄酒中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái)，隨著我國(guó)居民消費(fèi)水平的提高，葡萄酒的消費(fèi)量也日益上升，EC作為一種潛在的致癌物質(zhì)已經(jīng)逐漸引起了社會(huì)關(guān)注并成為了熱門研究對(duì)象，因此EC限量標(biāo)準(zhǔn)的制定勢(shì)在必行。

葡萄酒在釀造過(guò)程中，尿素與發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇結(jié)合是產(chǎn)生EC的主要途徑。尿素的來(lái)源主要是酵母代謝氨基酸(主要是精氨酸)和葡萄園施氮肥。氮是釀酒酵母保持發(fā)酵能力和生物活性的重要營(yíng)養(yǎng)元素，氮源的過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響葡萄酒的發(fā)酵狀態(tài)[5]。當(dāng)發(fā)酵葡萄汁中酵母可利用氮(yeast assimiable nitrogen, YAN)含量低于140 mg/L時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酒精發(fā)酵遲緩或者停滯[6]；當(dāng)葡萄汁中的YAN含量在200～480 mg/L時(shí)，葡萄酒的酒精發(fā)酵處于比較理想的狀態(tài)[7]。在生產(chǎn)過(guò)程中，添加酵母助劑可保證發(fā)酵的順利進(jìn)行，然而酵母助劑的用量對(duì)葡萄酒釀造過(guò)程中EC產(chǎn)量的影響研究很少。

本研究的目的是比較不同發(fā)酵處理對(duì)EC產(chǎn)量的影響，從而找到控制酒精發(fā)酵過(guò)程中EC含量的釀造工藝，服務(wù)于葡萄酒生產(chǎn)。同時(shí)，為我國(guó)葡萄酒中EC限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄(Cabernet Sauvignon)，2016年10月采收于河北懷來(lái)，成熟狀況、衛(wèi)生條件良好。酒精發(fā)酵酵母ST、BO213、F15和酵母助劑THIAZOTE均購(gòu)自法國(guó)LAFFORT公司；銨離子氮試劑盒Megazyme Ammonia Nitrogen Assay Procedure(96 Assays per kit)、氨基酸氮試劑盒Megazyme Primary Amino Nitrogen Assay Procedure(100 Assays per kit)，愛爾蘭Megazyme International Ireland有限公司；甲醇、冰醋酸(色譜級(jí))，美國(guó)Mreda公司；乙腈(色譜級(jí))，韓國(guó)SK chemicals公司；氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品、氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)物(EC-d5)，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

雙波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)，北京Lab-Tech公司；Agilent 6410串聯(lián)液質(zhì)儀，美國(guó)Agilent公司；Heal Force?Super Series NW超純水系統(tǒng)，上海Canrex分析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)研究不同商業(yè)酵母在赤霞珠葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中EC產(chǎn)量的差異性，選用ST、BO213、F15三種對(duì)氮源具有不同敏感度的酵母進(jìn)行試驗(yàn)，酵母接種量均為0.2 g/L。根據(jù)常規(guī)工藝設(shè)計(jì)，在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中添加0.2 g/L酵母助劑THIAZOTE。

同時(shí)本試驗(yàn)進(jìn)行不同用量酵母助劑的研究，在接種了0.2 g/L酵母F15(酒莊發(fā)酵赤霞珠葡萄酒相同的酵母)的發(fā)酵罐中分別添加了0、0.3、0.6 g/L的THIAZOTE酵母助劑，分別記為YNCK、YN0.3和YN0.6。

上述6個(gè)處理均設(shè)置3次重復(fù)，共18個(gè)獨(dú)立發(fā)酵單元，分別在發(fā)酵初期(比重1.090)、發(fā)酵中期(比重1.040)和發(fā)酵末期(比重1.000)取樣測(cè)定。

赤霞珠葡萄汁分析結(jié)果顯示含糖量233 g/L、酸度(酒石酸計(jì))7.90 g/L、pH 3.22、葡萄汁初始比重為1.096。

葡萄原料→分選→除梗破碎(添加30 mg/L SO2)→酒精發(fā)酵→分離→穩(wěn)定與澄清處理→裝瓶

發(fā)酵前期溫度控制在20～22 ℃，每12 h進(jìn)行1次壓帽操作；發(fā)酵中期溫度控制在25～28 ℃，每12 h進(jìn)行2次壓帽操作；發(fā)酵后期溫度控制在22～25 ℃，不進(jìn)行壓帽操作。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

采收當(dāng)天，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[8]在相應(yīng)葡萄地塊進(jìn)行土樣的采集、處理和貯存，測(cè)定土壤中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。葡萄采樣結(jié)束后，盡快送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行壓榨與澄清處理，同時(shí)取葡萄汁樣品，貯存于-20 ℃低溫冰箱待測(cè)。

1.4.1 土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的測(cè)定[9]

土壤中銨態(tài)氮含量的測(cè)定：采用氯化鉀浸提-靛藍(lán)比色法，計(jì)算公式如下：

(1)

式中：C,顯色液銨態(tài)氮的質(zhì)量濃度，μg/kg；V,顯色液體積，mL；ts,分取倍數(shù)；m,土樣的質(zhì)量，g。

土壤中硝態(tài)氮含量的測(cè)定：采用紫外分光光度法，計(jì)算公式如下：

(2)

式中：C,通過(guò)回歸方程算出的NO3-N含量；25,測(cè)定液的總體積，mL；D,稀釋倍數(shù)；m,鮮土樣質(zhì)量，g。

1.4.2 葡萄汁中酵母可利用氮的測(cè)定[10]

采用試劑盒檢測(cè)氨基酸態(tài)氮和銨離子氮含量。計(jì)算公式如下：

(3)

ΔA=(A1-A2)樣-(A1-A2)空白

(4)

式(3)中：X1,氨基酸態(tài)氮含量，mg/L；V,終體積，mL；MW,氮摩爾質(zhì)量，g/mol；ε,氮素在波長(zhǎng)340 nm處的消光系數(shù)；d,光路距離，cm；v,樣品體積，mL。

(5)

ΔA=(A1-A2)樣-(A1-A2)空白

(6)

式(5)中：X2,銨離子氮含量，mg/L；V,終體積，mL；MW,氮摩爾質(zhì)量，g/mol；ε,氮素在波長(zhǎng)340 nm處的消光系數(shù)；d,光路距離，cm；v,樣品體積，mL。

可同化氮含量/(mg·L-1)=X1+X2

(7)

1.4.3 葡萄酒理化指標(biāo)的測(cè)定[11]

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定。

1.4.4 葡萄發(fā)酵液或葡萄酒中EC含量的測(cè)定[12]

本試驗(yàn)利用EC-d5作內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，可以有效校正整個(gè)分析過(guò)程產(chǎn)生的誤差，使樣品處理更為簡(jiǎn)易，降低了對(duì)人員熟練程度的要求[13]。

樣品前處理：將酒樣搖勻，立即準(zhǔn)確取出1.00 mL于5 mL試管中，準(zhǔn)確加入25 μL 10 μg/mL的EC-d5內(nèi)標(biāo)工作液，旋渦振蕩5 s，吸取樣液過(guò)0.22 μm濾膜，待分析。

1.4.4.1 液相色譜-質(zhì)譜條件

XSELECT HSS T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)，Zorbax Eclipse Plus-C18預(yù)柱(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)。柱溫為40 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL，流速為0.3 mL/min；流動(dòng)相A為0.1%(V/V)乙酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫順序如表1所示。

電噴霧電離源正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)方式監(jiān)測(cè)，MRM參數(shù)見表2。

干燥氮?dú)鉁囟葹?20 ℃，流速為10 L/min；霧化器壓力20 psi；噴霧毛細(xì)管電壓4 000 V。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 The sequence of gradient elution

表2 MRM參數(shù)表Table 2 The parameter of multiple reaction monitoring

注：*為定量離子。

1.4.4.2 校正標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

按照內(nèi)標(biāo)法測(cè)定EC含量得到的校正標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性回歸方程為y=7.919 7x+0.006，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，方程線性較好，適合本試驗(yàn)中EC的含量測(cè)定。

圖1 內(nèi)標(biāo)法測(cè)定EC的校正標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The EC calibration standard curve

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，對(duì)葡萄酒中的理化指標(biāo)進(jìn)行多重比較分析。利用Excel繪制酒精發(fā)酵過(guò)程中的EC產(chǎn)量變化圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠葡萄園土壤中氮含量及葡萄中YAN測(cè)定

氮是釀酒葡萄樹體和果實(shí)生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)素。土壤中的氮素可分為有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮，本試驗(yàn)采集葡萄園土樣做含氮量測(cè)定，其中銨態(tài)氮含量為38.68 mg/kg, 硝態(tài)氮含量為20.46 mg/kg。土壤中銨態(tài)氮含量要高于硝態(tài)氮含量，根據(jù)河北省葡萄果園地力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，該試驗(yàn)地土壤中的氮處于較低水平[8]。

銨態(tài)氮是酵母可同化氮素的主要成分[10]，是釀酒酵母優(yōu)先利用的無(wú)機(jī)氮源。土壤中的銨態(tài)氮水平會(huì)直接影響葡萄果實(shí)中的酵母可利用氮含量，經(jīng)測(cè)定葡萄原料中的酵母可利用氮含量為188.53 mg/L。符合葡萄酒發(fā)酵所需最低140～150 mg N/L的要求[6]。

2.2 實(shí)驗(yàn)葡萄酒理化指標(biāo)檢測(cè)

酒精發(fā)酵結(jié)束后，葡萄酒經(jīng)自然澄清后，與酒泥分離，經(jīng)過(guò)穩(wěn)定處理后裝瓶，2個(gè)月后取樣檢測(cè)葡萄酒的理化指標(biāo)，結(jié)果如表3。

由表3可以看出，不同酵母和不同用量酵母助劑釀造的葡萄酒中理化指標(biāo)含量均無(wú)明顯差異。葡萄酒主要理化指標(biāo)正常，滿足酒精度≥7.0%，還原糖≤4 g/L和揮發(fā)酸≤1.2 g/L的要求[9]。葡萄酒發(fā)酵過(guò)程控制合理，符合干紅葡萄酒的發(fā)酵要求，保證了葡萄酒中EC含量的正常測(cè)定。

表3 赤霞珠葡萄酒理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indexes of Cabernet Sauvignon wine with different treatment

注：同列不同小寫字母表示p<0.05水平差異顯著。

2.3 不同酵母釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量的差異分析

精氨酸是葡萄汁中含量最豐富的氨基酸之一。在酒精發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)發(fā)酵液中精氨酸含量過(guò)高時(shí)，會(huì)在酵母菌內(nèi)代謝產(chǎn)生過(guò)量的尿素。酵母細(xì)胞內(nèi)的尿素不會(huì)立即降解，使胞內(nèi)的尿素含量積累過(guò)多，酵母菌的氮代謝受到抑制。酵母菌將過(guò)多的尿素由胞內(nèi)釋放到發(fā)酵液中，尿素和發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇結(jié)合生成EC。

發(fā)酵過(guò)程中不同酵母釀造的赤霞珠葡萄酒EC產(chǎn)量的差異性結(jié)果如圖2，結(jié)果顯示酵母ST、BO213和F15釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量存在差異。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母菌容易利用的谷氨酸、谷氨酰胺等小分子氮源越來(lái)越少，酵母菌開始代謝精氨酸、核苷酸等含氮化合物，其代謝產(chǎn)生的瓜氨酸、氨甲酰磷酸、尿素等分泌到酒體中，與已積累的乙醇反應(yīng)生成EC[14]。在發(fā)酵初、中期階段，3種酵母釀造葡萄酒均有少量的EC產(chǎn)生，而在不同酵母釀造的葡萄酒之間EC的產(chǎn)量具有差異。發(fā)酵末期，酵母BO213與ST、F15相比，釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量分別增長(zhǎng)了45.0%和16.0%。這可能與不同酵母需氮量、氮代謝及尿素分泌能力有關(guān)。

a-發(fā)酵初期(1.090)；b-發(fā)酵中期(1.040)，此時(shí)添加酵母助劑；c-發(fā)酵末期(1.000)圖2 不同酵母處理不同發(fā)酵階段的EC產(chǎn)量Fig.2 Comparison of three different yeasts fermented on EC production during fermentation

2.4 不同用量酵母助劑處理釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量的差異

在酒精發(fā)酵過(guò)程中，酵母進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖和代謝，會(huì)逐漸消耗葡萄汁中的氮源物質(zhì)。當(dāng)發(fā)酵液中氮源物質(zhì)缺乏時(shí)，會(huì)延緩發(fā)酵甚至停滯。酵母助劑的成分主要是(NH4)2HPO4，可以補(bǔ)充酵母所需氮源，加快發(fā)酵速率。而過(guò)量的(NH4)2HPO4會(huì)使酵母代謝過(guò)剩，從而產(chǎn)生EC。

本試驗(yàn)酒精發(fā)酵過(guò)程中，不同用量酵母助劑處理釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量差異性如圖3。在發(fā)酵中期添加酵母助劑后，不同用量酵母助劑處理釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量與發(fā)酵前期相比均有增長(zhǎng)，且YN0.3、YN0.6均比對(duì)照組YNCK釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量高。與發(fā)酵中期相比，YNCK、YN0.3、YN0.6在發(fā)酵末期的EC產(chǎn)量分別增長(zhǎng)了37.5%、38.0%、33.3%，表明酵母助劑的使用有提高EC產(chǎn)量的風(fēng)險(xiǎn)。而在發(fā)酵末期，不同用量酵母助劑釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量差異顯著，與YNCK相比，YN0.3和YN0.6釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量分別增加了25.5%和45.5%，結(jié)果顯示，酵母助劑用量增加所釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量越大。

a-發(fā)酵初期(1.090)；b-發(fā)酵中期(1.040)，此時(shí)添加酵母助劑；c-發(fā)酵末期(1.000)圖3 酵母助劑不同用量處理不同發(fā)酵階段EC產(chǎn)量Fig.3 Comparison of three different yeast nutrients used on EC production during fermentation

2.5 不同處理獲得的赤霞珠葡萄酒中EC含量結(jié)果分析

葡萄酒發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過(guò)澄清、過(guò)濾、裝瓶，置于瓶?jī)?chǔ)室(溫度在15～20 ℃，空氣相對(duì)濕度在65%～70%)儲(chǔ)存。裝瓶2個(gè)月后取樣，測(cè)定各處理獲得的赤霞珠葡萄酒中的EC含量如表4。

表4 赤霞珠葡萄酒中的EC含量 單位：μg/LTable 4 EC content in Cabernet Sauvignon wine

由表4可以看出，不同處理釀造的赤霞珠葡萄酒中EC含量均較低，都遠(yuǎn)低于美國(guó)或歐盟限定標(biāo)準(zhǔn)[15]。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)主要研究不同發(fā)酵處理對(duì)赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量的影響，選擇不同酵母和不同用量酵母助劑發(fā)酵進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，不同酵母釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量差異顯著，就選擇的3種酵母而言，酵母BO213的EC產(chǎn)量多于酵母F15和ST。在選擇酵母F15的前提下，發(fā)酵過(guò)程中使用酵母助劑用量多的赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量較高，產(chǎn)量高低順序?yàn)閅N0.6>YN0.3>YNCK。發(fā)酵過(guò)程中，赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量的變化趨勢(shì)為，發(fā)酵初期階段和發(fā)酵中期階段產(chǎn)生較少，發(fā)酵后期階段EC產(chǎn)量較多。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，測(cè)定的赤霞珠葡萄酒中的EC含量范圍為1.9～8.0 μg/L，均未超過(guò)美國(guó)或歐盟限量水平[15]。在實(shí)驗(yàn)葡萄園現(xiàn)有的土壤氮素營(yíng)養(yǎng)水平下，使用酵母ST(接種量為0.2 g/L)或使用酵母F15(接種量為0.2 g/L)且不添加酵母助劑，可以使赤霞珠葡萄酒發(fā)酵順利進(jìn)行，釀造的葡萄酒中EC的產(chǎn)量符合美國(guó)或歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)可以使葡萄酒中的EC產(chǎn)量保持在較低水平。