朱廣素，王剛*，王園園，馬方勵，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(無限極(中國)有限公司，廣東 廣州，510623)

人體腸道是一個多元化、充滿活力的微生態(tài)系統(tǒng)，為微生物的生長繁殖提供了絕佳的營養(yǎng)環(huán)境[1-2]。人體腸道菌群按照生理功能不同分為3類：共生菌、條件致病菌和病原菌[3]。雙歧桿菌屬和乳桿菌屬是腸道共生菌中重要的兩類菌，因其在促進消化、改善胃腸道健康、增強腸道免疫、抑制致病菌生長、調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用，被作為益生菌，廣泛地用于膳食補充劑和特定的功能性食品[4-7]。

參照聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)/世界衛(wèi)生組織(WHO)和歐盟制定的益生菌安全性評估指南[8-9]，對于將作為益生菌使用的乳酸菌，需從以下步驟判斷其安全性：1)傳統(tǒng)的生理生化檢測，以確定其生物學(xué)分類及菌株培養(yǎng)等基本信息；2)體外致病基因檢測，確保該菌株無致病性基因；3)抗生素抗性實驗和細菌易位實驗，檢測菌株是否具有耐性藥和轉(zhuǎn)移性；4)體內(nèi)致病性檢測，包括動物實驗和臨床試驗。按照我國《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范2003版》[10]的要求，安全性毒理學(xué)評價實驗分為4個階段：1)急性毒性試驗；2)遺傳毒性試驗，30 d喂養(yǎng)試驗，傳統(tǒng)致畸實驗；3)亞慢性毒性實驗——90 d喂養(yǎng)試驗、繁殖試驗、代謝試驗；4)慢性毒性試驗(包括致癌試驗)。對于有長期安全使用歷史的乳酸菌，可以先進行第一、二階段的毒性試驗，經(jīng)初步評價后，決定是否需要進行下一階段的毒性試驗。

本研究團隊前期對來自中國不同地區(qū)長壽村健康人體糞便樣品中的乳酸菌進行了分離鑒定，研究了其耐酸耐膽鹽等生理生化特性及生理功能，并對其全基因組信息進行了分析檢測。在上述研究的基礎(chǔ)之上，參照相關(guān)的國家標(biāo)準要求[10-13]，對其中具有顯著緩解代謝綜合征功能的青春雙歧桿菌Z25和羅伊氏乳桿菌138-1進行安全性評價，包括急性毒性實驗、28 d短期毒理實驗、致畸實驗、細菌移位實驗，以確定其是否能作為安全、可食用的益生菌用于后續(xù)的產(chǎn)品研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

主要試劑：MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；生理鹽水，辰欣藥業(yè)股份有限公司；本研究所用試劑盒均購于南京建成生物技術(shù)公司；其他常用試劑均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

主要實驗設(shè)備：高溫高壓滅菌鍋，SANYO；厭氧工作站，Electrotek；大容量冷凍離心機，Thermo；冷凍干燥機，Virtis；多功能酶標(biāo)儀，Thermo；全自動脫水機，Leica；半自動切片機，Leica；全自動染色機，Leica；KD-160型電子秤，東莞百利達健康器材有限公司；精密電子天平EL3002，Mettler Toledo；電子分析天平BSA124S，Sartorius；CELLtac α型血球分析儀，NIHON KOHDEN；光學(xué)顯微鏡，OLYMPUS；正置生物顯微鏡，OLYMPUS；體視顯微鏡，OLYMPUS；游標(biāo)卡尺，成都成量工具集團有限公司。

1.2 實驗菌株

實驗用菌株均來自于食品生物技術(shù)中心菌種保藏中心(Culture Collection of Food Microorganisms, CCFM)。青春雙歧桿菌Z25(CCFM8630)分離自湖北省鐘祥市95歲健康男性糞便，羅伊氏乳桿菌138-1(CCFM8631)分離自廣西省巴馬縣57歲健康女性糞便。

1.3 實驗動物及適應(yīng)性喂養(yǎng)

實驗中所使用動物為清潔級SD大鼠(雌雄各半)，體重180～220 g，購自浙江省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2014-0001。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，環(huán)境溫度為22±2 ℃，濕度為(55±5)%，光照為12 h光暗交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)急性毒性實驗、28 d喂養(yǎng)實驗和致畸實驗的需要進行隨機分組。除致畸實驗外，實驗期間大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，自由飲水，同室分籠飼養(yǎng)。

1.4 實驗方法

1.4.1 受試菌懸液的制備

將菌株接種于含0.5 g/LL-半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基中，置于厭氧工作站37 ℃活化兩代后用于制備動物實驗所需凍干粉。將培養(yǎng)好的菌液以8 000×g離心20 min，無菌PBS緩沖液清洗菌體2遍，用100 g/L的脫脂乳、30 g/L海藻糖和30 g/L的蔗糖作為凍干保護劑重懸菌體，冷凍干燥制成菌粉，并對其進行平板菌落計數(shù)。參照文獻報道[14]，用無菌生理鹽水將菌粉調(diào)整為2×108(低劑量)、2×109(中劑量)、2×1010CFU/mL(高劑量)，制備成3種劑量不同的菌懸液，用于后續(xù)動物實驗。

1.4.2 急性毒性實驗

按照GB 15193.3—2014《食品安全國家標(biāo)準急性經(jīng)口毒性試驗》[11]和《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范2003版》[10]要求進行實驗。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，隨機選取雌雄大鼠分為3組，每組雌雄各10只，分別為對照組、青春雙歧桿菌Z25高劑量組(BA-H)和羅伊氏乳桿菌138-1高劑量組(LR-H)。其中對照組大鼠灌喂滅菌凍干保護劑稀釋液，實驗組大鼠灌喂益生菌稀釋液。每天定時經(jīng)口灌胃1次，劑量為2 mL/只，連續(xù)灌胃7 d。給予受試菌懸液后，觀察并記錄大鼠的行為、死亡情況和中毒表現(xiàn)等。在實驗開始和結(jié)束時，用KD-160型電子秤稱取并記錄動物體重，實驗結(jié)束處死大鼠，進行解剖檢查，記錄心、肝、脾、肺、腎變化并用精密電子天平EL3002稱重，計算臟器指數(shù)，出現(xiàn)病變時應(yīng)做病理組織學(xué)檢測。

1.4.3 28天喂養(yǎng)實驗

按照GB 15193.22—2014《食品安全國家標(biāo)準28天經(jīng)口毒性試驗》[12]和《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范2003版》[10]要求進行實驗。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，隨機選取雌雄大鼠分為7組，每組雌雄各10只，分別為對照組、青春雙歧桿菌Z25低劑量組(BA-L)、青春雙歧桿菌Z25中劑量組(BA-M)、青春雙歧桿菌Z25高劑量組(BA-H)和羅伊氏乳桿菌138-1低劑量組(LR-L)、羅伊氏乳桿菌138-1中劑量組(LR-M)、羅伊氏乳桿菌138-1高劑量組(LR-H)。其中對照組大鼠灌喂滅菌凍干保護劑稀釋液，實驗組大鼠灌喂不同劑量的益生菌稀釋液。每天定時經(jīng)口灌胃1次，劑量為2 mL/只，連續(xù)灌胃28 d。給予受試菌懸液后，觀察并記錄大鼠的行為表現(xiàn)、死亡情況和中毒體征等。在實驗期間，用KD-160型電子秤稱取并記錄體重和攝食量，計算食物利用率；實驗結(jié)束時，計算動物體重增長量、總攝食量和總食物利用率。

實驗結(jié)束處死大鼠，進行紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)及分類、血紅蛋白濃度、血小板計數(shù)等血液學(xué)指標(biāo)測定；進行血生化檢查，測定指標(biāo)包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血蛋白(ALB)、總蛋白(TP)；先對高劑量組和對照組大鼠進行臟器組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對較低劑量組相應(yīng)器官及組織進行檢查，檢測臟器包括心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸。

1.4.4 致畸實驗

按照GB 15193.14—2015《食品安全國家標(biāo)準致畸試驗》[13]和《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范2003版》[10]要求進行實驗。選取健康、性成熟清潔級SD大鼠，1∶1合籠交配，飼料為大鼠營養(yǎng)繁殖飼料，自由飲水。每日對雌鼠檢查陰栓，查出陰栓當(dāng)日作為受孕0 d，用KD-160型電子秤稱量體重。孕鼠分籠飼養(yǎng)，隨機分為7組，每組12只。實驗組設(shè)置同1.4.3，在孕期第7～16天，每天定時經(jīng)口灌胃1次，根據(jù)母體體重調(diào)整灌胃體積；在母鼠受孕的第0，7，12，16，20天用KD-160型電子秤稱體重。

于大鼠孕第20天麻醉放血處死孕鼠，迅速取出子宮，逐個檢查胎鼠有無外觀異常，用KD-160型電子秤稱量懷孕子宮重、子宮胎盤重和胎盤重，用精密電子天平EL3002稱取卵巢和子宮的重量。將一半胎鼠放入Bouin氏液中固定，檢查內(nèi)臟。另一半胎鼠去皮、去內(nèi)臟及脂肪后，放入0.01%茜素紅液染色，并經(jīng)透明液脫色后檢查骨骼發(fā)育情況。

1.4.5 細菌易位實驗

將經(jīng)28 d喂養(yǎng)實驗的大鼠處死后，無菌環(huán)境下解剖，用無菌手術(shù)刀取心、肝、脾、肺、腎等臟器并切開，用一次性無菌棉簽擦拭各臟器切面，涂布于含0.5 g/L半胱氨酸的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置厭氧培養(yǎng)24～48 h，觀察有無特征菌落生長[15]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Graphpad Prism5進行繪圖，使用SPSS 22.0對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。相同字母標(biāo)注代表無顯著性差異，p<0.05則認為差異顯著。與雌性對照組之間有顯著差異：p<0.05標(biāo)注*，p<0.01標(biāo)注**，p<0.001標(biāo)注***；與雄性對照組之間有顯著差異：p<0.05標(biāo)注#，p<0.01標(biāo)注##，p<0.001標(biāo)注### 。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實驗

2.1.1 急性毒性試驗對大鼠體重的影響

不同菌株灌胃大鼠，實驗期間各組大鼠生長、行為和精神狀態(tài)良好，未見中毒癥狀或死亡現(xiàn)象。圖1所示為各實驗組大鼠的體重增量(圖1-A)及進食量(圖1-B)，灌喂益生菌組體重增幅較對照組均有較明顯的降低，且表現(xiàn)出較明顯的性別差異，BA對雌性體重增幅影響較雄性略明顯；同時，與對照組相比，灌胃益生菌降低了大鼠的進食量。

圖1 益生菌對急性毒性大鼠體重增量及進食量的影響Fig.1 Weight gain and food intakeof acute toxicity test

2.1.2 急性毒性實驗對大鼠臟器指標(biāo)的影響

7 d實驗結(jié)束后，對大鼠進行解剖，觀察臟器并稱重。觀察結(jié)果表明，大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺及腎臟均無可見病變。各組大鼠的臟器指數(shù)如表1所示，灌胃不同益生菌的試驗組大鼠與對照組相比，均無顯著性差異。

表1 急性毒性實驗臟器指數(shù)Table 1 Organ index of acute toxicity test

2.2 28 d喂養(yǎng)毒性試驗

2.2.1 不同菌株對大鼠體重及食物利用率的影響

用不同劑量的益生菌灌胃大鼠28 d，大鼠生長、行為和精神狀態(tài)良好，未見中毒癥狀或死亡現(xiàn)象。圖2所示為各實驗組大鼠的體重增量(圖2-A)及食物利用率(圖2-B)，結(jié)果表明各組大鼠體重增量與食物利用率均表現(xiàn)出性別差異，灌喂不同劑量益生菌組的雌性大鼠體重增幅較對照組均有降低，與食物利用率的結(jié)果相一致；灌胃青春雙歧桿菌Z25對體重增量和食物利用率的影響大于羅伊氏乳桿菌138-1，提示該2株菌具有潛在的減肥功能。

2.2.2 大鼠臟器指標(biāo)的影響

圖2 益生菌對28 d喂養(yǎng)大鼠體重增量及食物利用率的影響Fig.2 Weight gain and food utilization rate of 28 day feeding toxicity test

實驗結(jié)束后，對大鼠進行解剖，觀察臟器并稱重。結(jié)果表明，大鼠肝臟、脾臟及腎臟均無可見病變。各組大鼠的臟器指數(shù)均無顯著性差異。

2.2.3 不同菌株對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

不同劑量的益生菌灌胃28 d后，對各組大鼠血液的血脂指標(biāo)(TC、TG)、肝功能指標(biāo)(ALT、AST)、葡萄糖(GLU)及蛋白指標(biāo)(ALB、TP)、腎功能指標(biāo)(BUN、Cr)等進行測定，結(jié)果如圖3所示。灌胃益生菌28 d后，與對照組相比，雌性BA-L、LR-M及雄性BA-L組TC含量有所提高；雌性BA-M、LR-L、LR-M及雄性BA-L組TG含量有所升高；雄性BA-L和LR-L組ALT含量有所增加，雄性LR-M和LR-H組AST含量有所下降，雌性大鼠的ALT和AST指標(biāo)與對照組均無顯著差別。

圖3 益生菌對28 d喂養(yǎng)大鼠血脂及肝功能指標(biāo)的影響Fig.3 Blood lipid and liver function index of 28 day feeding toxicity test

如圖4所示，灌胃不同濃度的益生菌，血液中的葡萄糖含量也呈現(xiàn)部分的升高，與對照組相比，雄性BA-M、BA-H和LR-M組GLU含量少量升高，而雌性大鼠組別中GLU升高的為BA-L和LR-H組。

2.2.4 不同菌株對大鼠血液學(xué)檢查的影響

灌胃不同濃度的益生菌28 d后，對各組大鼠進行血液學(xué)檢查，各實驗組紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)及分類、血紅蛋白濃度、血小板計數(shù)等指標(biāo)均無顯著差異。

2.2.5 不同菌株對大鼠組織病變的影響

對灌胃28 d高劑量益生菌大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、睪丸、卵巢、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸和胰腺等器官固定后，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片和H&E染色，光鏡觀察組織病理學(xué)改變(圖5～圖6)。

鏡檢結(jié)果顯示：各實驗組雄性及雌性大鼠中，部分肺組織樣本均出現(xiàn)不同程度的支氣管性肺炎，與對照組相比，未見明顯加重，提示非益生菌相關(guān)性病變；且因?qū)嶒瀯游餅榍鍧嵓塖D大鼠，出現(xiàn)一定比例的支氣管性肺炎屬正?，F(xiàn)象，發(fā)病的試驗大鼠也并未表現(xiàn)出明顯異常。各實驗組雄性及雌性大鼠肺臟組織偶見出血，發(fā)生率較低，且與對照相比，未見明顯加重或發(fā)生率升高，提示非益生菌相關(guān)性病變。各實驗組雌雄大鼠，除肺臟之外的其他組織，均未見明顯的組織病變。

2.3 致畸實驗

2.3.1 不同乳酸菌灌胃對孕鼠生殖功能的影響

不同劑量的益生菌灌胃孕鼠，對其生殖功能及胚胎形成的影響如表2所示。與NC組相比，益生菌組終末期體重(GD20)均有不同程度的下降，其中LR組有顯著差異；灌胃益生菌組的孕鼠子宮胎盤重、子宮重及子宮臟體系數(shù)均高于NC組；而懷孕子宮重、卵巢重、卵巢臟體系數(shù)、黃體數(shù)等指標(biāo)，各實驗組孕鼠均未見統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3.2 不同乳酸菌灌胃對胎仔外觀的影響

不同劑量的益生菌灌胃孕鼠，比較各組胎仔總數(shù)、總重、均重、身長、尾長、雌雄比及外觀畸形率等指標(biāo)，未見明顯差異，各組胎仔外觀畸變率均為0。

2.3.3 不同乳酸菌灌胃對胎仔內(nèi)臟的影響

不同劑量的益生菌灌胃孕鼠，對各實驗組胎仔窩別內(nèi)臟變異率及畸形率進行檢查。結(jié)果顯示，各組胎仔窩別內(nèi)臟變異率均為0，NC組胎仔窩別內(nèi)臟畸形率為(1.39±4.81)%，畸變類型為腎異位；其余各組未見明顯異常改變。

表2 對孕鼠生殖功能及胚胎形成的影響Table 2 Effects on reproductive function and embryo formation in pregnant rats

注：臟體系數(shù)/%=臟器質(zhì)量/動物體質(zhì)量×100。

2.3.4 不同乳酸菌灌胃對胎仔骨骼的影響

結(jié)果顯示，各組胎仔窩別骨骼畸形率從NC組至LR-H組依次為3.47%、6.88%、6.35%、5.83%、7.74%、7.94%和9.29%，與NC組相比，灌胃益生菌組畸變率略有升高，但仍處于較低的比率范圍，同時無顯著性差異，且部分升高并無明顯的劑量效應(yīng)；畸變類型主要為間頂骨、胸骨、肋骨、腰椎、骶椎缺失、胸骨分離和胸骨分叉，其中間頂骨、胸骨、腰椎、骶椎缺失可能與孕鼠孕期未到有關(guān)。

2.4 細菌易位實驗

對灌胃益生菌28 d的大鼠臟器無菌切開，取其切面涂布于含0.05%半胱氨酸的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置厭氧培養(yǎng)24～48 h后，均無特征性菌落生長，該結(jié)果表明2株菌在宿主體內(nèi)未發(fā)生細菌易位現(xiàn)象。

3 討論

作為腸道共生微生物，乳桿菌和雙歧桿菌因其在食品和膳食補充劑中較長的使用歷史被認為是無致病性、安全可食用的。然而，從理論上講益生菌可能存在以下副作用：進入血液引發(fā)系統(tǒng)性感染；產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物；對敏感人群的過度免疫刺激；耐藥基因的轉(zhuǎn)移[9]。近年來，越來越多的新的益生菌菌種(如羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌)被開發(fā)使用，鑒于其使用歷史不長，因此其安全性還需進一步評價[16]。

本研究按照相關(guān)文件進行了毒理學(xué)評價，與李金敏[14]等的報道一致，益生菌灌胃不會對大鼠的臟器和行為造成影響。灌喂不同劑量的益生菌組體重增幅較對照組均有降低，且表現(xiàn)出明顯的性別差異，青春雙歧桿菌Z25對雌性體重增幅影響較雄性略明顯；同時，檢測到灌胃益生菌可降低大鼠的進食量及食物利用率。以上結(jié)果表明，青春雙歧桿菌Z25和羅伊氏乳桿菌138-1可以通過降低大鼠的食欲，從而進一步影響其體重，提示該2株菌具有潛在的減肥功能[17-18]。

血液成分或細胞發(fā)生異常，可以反映全身血液系統(tǒng)、組織器官的病變，因此動物血液學(xué)檢查在毒理學(xué)研究中十分重要。有研究表明，菌血癥的發(fā)生與乳桿菌(主要是鼠李糖乳桿菌)有關(guān)，免疫功能低下的病人更容易感染[19]。本研究結(jié)果表明，血液中蛋白指標(biāo)、肝功能指標(biāo)、腎功能指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，證實該實驗用益生菌不會對肝腎造成損傷。益生菌灌胃對雄性血脂指標(biāo)(TC、TG)無明顯影響，中劑量的羅伊氏乳桿菌138-1會導(dǎo)致雌性大鼠TC和TG含量略微升高，但仍處于報道的正常范圍內(nèi)[20]，而針對這2株菌的前期研究表明，這2株菌對由高糖高脂飼料導(dǎo)致的大鼠代謝綜合征具有顯著的緩解作用。已有多個研究表明，補充益生菌能緩解高脂飲食引發(fā)的血糖升高[21-23]，而益生菌對正常飲食大鼠血糖的影響鮮有報道。從本研究結(jié)果來看，針對正常飲食的健康大鼠，這2株益生菌雖然對血糖血脂有一定的影響，但血糖血脂的變化都在正常范圍內(nèi)，且并沒有明顯的劑量效應(yīng)，提示該變化可能與大鼠血糖血脂水平的正常浮動有關(guān)。

致畸實驗結(jié)果表明益生菌各劑量組對胎仔發(fā)育、外觀及內(nèi)臟畸形均無明顯影響，提示2株益生菌無致畸作用。細菌易位是指位于腸道中的細菌或內(nèi)毒素穿過腸上皮屏障，經(jīng)粘膜固有層進入腸系膜淋巴結(jié)，經(jīng)人體循環(huán)至肝、腎、脾等無菌的組織器官的過程[24]。與宋靜頤[25]等人的研究一致，本實驗結(jié)果表明，不同劑量的益生菌灌胃大鼠，均未在肝、腎、脾等部位檢測到特征菌落，證實2株實驗菌株在大鼠體內(nèi)不會發(fā)生細菌易位。相反，王堅鏘[26]等通過給腹腔感染的大鼠補充嗜酸乳桿菌，發(fā)現(xiàn)益生菌補充能明顯降低大鼠血、肺臟、肝臟和腸系膜淋巴結(jié)等組織的細菌易位；李京京[27]等通過建立大鼠缺血再灌注模型，證實了植物乳桿菌L2能夠抑制腸道損傷導(dǎo)致的細菌易位。

綜合上述實驗結(jié)果，可初步證實青春雙歧桿菌Z25和羅伊氏乳桿菌138-1對于大鼠安全，可以應(yīng)用于產(chǎn)品研發(fā)和工業(yè)生產(chǎn)。

4 結(jié)論

通過對青春雙歧桿菌Z25和羅伊氏乳桿菌138-1進行系統(tǒng)的安全性評價，急性毒性實驗和28 d毒理實驗結(jié)果表明，灌胃不同劑量的益生菌，實驗期間大鼠除體重增長幅度略有下降以外，日常表現(xiàn)及體征一切正常，均未表現(xiàn)出明顯的組織病變和中毒現(xiàn)象；致畸實驗表明，益生菌實驗組大鼠體重略有下降，對孕鼠生殖功能、胎仔外觀及內(nèi)臟均無明顯影響；血液學(xué)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)；2株菌株均未發(fā)生細菌易位現(xiàn)象。綜上所述，青春雙歧桿菌Z25和羅伊氏乳桿菌138-1對大鼠安全，且相對于人體重，安全性評價中大鼠益生菌的攝入比例遠高于產(chǎn)品推薦的消費者日常益生菌攝入比例，因此該2株菌可用于后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)及實際生產(chǎn)。