蔣永梅，高亞敏，姚 拓，段淇斌，趙冬青,李政璇，李海云，楊曉玫，張建貴

(1.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室甘肅省草業(yè)工程實驗室中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省農(nóng)牧廳外資項目管理辦公室，甘肅 蘭州 730070)

近年來，土壤污染已成為全球性問題，特別是在我國，為使作物快速生長和高產(chǎn)，長期過量施用化肥、農(nóng)藥,并帶來了一系列問題，如造成農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本增加、土壤和環(huán)境污染、土壤肥力下降，并逐漸影響到食品安全[1]。因此，研制新型肥料以部分替代化肥來實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展變得十分迫切和必要。

微生物肥料是最具替代化肥潛力的一類環(huán)境友好和低能耗型肥料，從菌種角度主要包括植物根際促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR)類、根瘤菌(Root Nodule Bacteria)類和叢枝菌根菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)類3種[2]。微生物菌肥較大的一個分支是促生菌肥類，植物根際促生菌指生存于植物根際、根表，并能直接或間接地促進或調(diào)節(jié)植物生長的微生物，它們通過定殖于植物根系，優(yōu)先占領根際，具有固氮、溶解有機磷和無機磷、分泌植物激素和抗生素類物質(zhì)的功能，從而促進植物生長發(fā)育，抑制病原菌生長，且能明顯改善多年生植物連作障礙[2-7]。微生物肥料施用理念為“菌株來源于該植物，受益于該植物”，目前，研究主要集中于對施用菌肥的植物生長效果[4]，研究表明PGPR菌肥對宿主植物的株高、莖粗、植物量、葉綠素含量、根系形態(tài)等方面均有不同程度的促進作用[8]。然而，PGPR菌肥也能促進非宿主植物的生長。如：從小麥(Treiticumaestivum)、紅三葉(Trifoliumpratense)、苜蓿(Medicagosativa)根際篩選出的優(yōu)良PGPR制成的菌肥可顯著促進油菜生長[9]；從小麥、垂穗披堿草(Elymusnatans)、苜蓿、燕麥(Avenasativa)根際篩選出優(yōu)良PGPR制成菌肥，PGPR菌肥+半量化肥能夠顯著提高燕麥不同生育時期株高、生物量，改善根系形態(tài)特征[10]；從油菜(Brassicacampestris)、小麥、蘆葦(Phragmitesaustralis)根際土壤中篩選出14株PGPR，所得菌株可定殖于豇豆(Vignaunguiculata)和番茄(Lycopersicnesculentun)根際，且促生效果較好[11]。然而，PGPR菌肥對非宿主植物的促進研究相對較少，因此，本研究以小黑麥(×TriticaleWittmack)和貓尾草(Urariacrinita)為研究對象，用盆栽試驗來探究根際促生菌對非宿主植物生長的影響，以期為擴大PGPR適用范圍提供基礎數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

小黑麥品種為石大一號，貓尾草品種為岷山貓尾草，種子均由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院杜文華教授提供。

1.2 供試菌株

供試菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院微生物實驗室提供，從多種植物根系及根際土壤中分離篩選出10株PGPR菌，菌株編號分別為NYRS2、NCRS1、PYRS1、NCRP2、PPRS3、MCRP1、G、ZKRP1、ZKRP2、ZNHP2[12-13](表1)。

1.3 菌株組合篩選

菌株組合篩選采用平板對峙法[14-15]。

1.4 菌肥的制作

1.4.1載體配方 菌肥載體具體配方詳見參考文獻[4]。

1.4.2菌懸液制備 根據(jù)菌株間拮抗反應、菌株促生特性及菌株生長速度等特性，篩選獲得最佳菌株組合，分別將菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上振蕩48 h(180 r·min-1)，備用。

1.4.3菌肥制作 菌肥載體具體配方詳見參考文獻[4]。本試驗菌肥栽體(泥炭∶木炭∶花土=2∶2∶1)施用量為每110 g土中17 g。

表1 供試菌株特性Table 1 Characteristics of tested strains

1.5 試驗設計

2016年11月在甘肅農(nóng)業(yè)大學溫室中進行盆栽試驗。選用顆粒飽滿且大小一致的小黑麥、貓尾草種子，用1%的NaClO溶液滅菌10 min后，用無菌水清洗3次，然后種植于一次性塑料杯中(規(guī)格：外徑9.5 cm×內(nèi)徑8.5 cm×高12 cm)，每杯裝110 g無菌花土，種植小黑麥10株·杯-1，貓尾草30株·杯-1，每種植物種植20杯。試驗共設置4個處理：不施肥(CK)；施宿主植物生物菌肥(NF1)，宿主植物菌肥由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院微生物實驗室提供，施肥量為每個塑料杯17 g菌肥載體(有效活菌數(shù)2×109cfu·g-1)；施非宿主植物生物菌肥(NF2)，由1.2中篩選最佳菌株制作的菌肥，施肥量同NF1；施化肥(磷酸二銨)，施肥量為每杯0.15 g磷酸二銨+17 g空白載體。每個處理重復5次，并將5次重復放在27 cm(長)×18.5 cm(寬)×8.5 cm(高)的白色保鮮盒中，用保鮮膜對塑料杯口密封，待種子長出兩片葉子時，將保鮮膜取掉，在每個白色保鮮盒中每2 d澆300 mL無菌水，一周澆300 mL營養(yǎng)液，待植物生長50 d左右，測定各項指標。

1.5.1指標測定及方法 株高(cm)：每個塑料杯中隨機選取5株，用直尺測定自然高度[16]；莖粗(mm)：每個塑料杯中隨機選取3株，用游標卡尺測量莖粗[17]；葉綠素含量(%)：每個塑料杯中隨機選取5個植物葉片，用葉綠素儀(Soil and Plant Analyzer Development 502，SPAD-502)進行測定；生物量(g)：每個塑料杯中隨機選取10株，將植株地上、地下部分分開采集，裝入自封袋，用電子天平分別稱量地上、地下植物鮮重，后裝入信封中置于烘箱10 h(105 ℃)，待植物完全烘干后分別稱取地上、地下干重[18]；根系形態(tài)：采用根系掃描儀(LA2400 Scanner，Epson Expression 1000XL)對植物根系進行掃描，獲得總根長、根表面積、根平均直徑、根體積及不同根直徑下的總根長等參數(shù)[19]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0和Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖(數(shù)據(jù)均以平均值或平均值加標準誤表示)，并通過One-Way ANOVA和Duncan法進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 菌株組合篩選

2.1.1供試菌株之間的拮抗反應 已選擇的10株優(yōu)良PGPR菌株，綜合固氮、溶磷、分泌激素、生防等特性，采用平板對峙法測定菌株間拮抗性，各菌株間兩兩進行組合，每個組合重復3次，所得結果如表2列。

2.1.2菌株對病原菌的抑制效果 從10株供試菌株中篩選出6株拮抗菌(表3)，所篩選的拮抗菌株對不同病原菌防治效果不同，其中對病原菌抑菌率大于50%的菌株有NCRP2、NYRS2，其余菌株對病原菌的抑菌率均小于50%。其中，NCRP2菌株對小麥長蠕孢菌(Helminthosporiumtritici-vulgaris)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumn)、馬鈴薯立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、油菜菌核菌(Sclerotiniasclerotiorum)和玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)抑制效果較好，可見NCRP2對病原菌防治具有廣譜性。

根據(jù)PGPR菌株特性(表1)、菌株間的拮抗反應及其對病原菌的抑制作用(表2、表3)，從中篩選出最佳菌株組合為NCRP2+PPRS3+G+ZKRP2，按照1.4操作步驟制作菌肥，并進行盆栽試驗。

2.2 生物菌肥對小黑麥和貓尾草株高的影響

與不施肥(CK)相比，NF1處理能夠促進小黑麥生長，提高小黑麥的株高，但影響不顯著(P>0.05)，化肥可以增加小黑麥株高，經(jīng)NF2處理的小黑麥株高最低，但NF2和化肥處理對小黑麥株高無顯著影響(P>0.05)。與不施肥(CK)相比，不同施肥處理不增加貓尾草株高，除NF2對貓尾草的株高有顯著負影響(P<0.05)外，其他不同施肥處理對貓尾草株高影響沒有顯著性差異(P>0.05)。由此可見，NF2生物菌肥對非宿主小黑麥株高沒有顯著影響，但對貓尾草株高有顯著負影響(圖1)。

2.3 生物菌肥對小黑麥和貓尾草莖粗的影響

不同處理間小黑麥莖粗均表現(xiàn)無顯著性差異(P>0.05)，各處理對小黑麥莖粗影響總體表現(xiàn)為NF2>NF1>化肥>CK，且NF2與NF1相比，NF2處理使小黑麥莖粗增加了6.79%(圖2)。與CK相比，其余處理均顯著增加貓尾草莖粗(P<0.05)，其中NF2和化肥處理影響最大，兩者之間無顯著性差異(P>0.05)，但與其余處理均有顯著性差異(P<0.05)，各處理對貓尾草莖粗總體表現(xiàn)為NF2=化肥>NF1>CK，且NF2與NF1相比使莖粗增加33.74%。由此可見，化肥、NF2、NF1處理均具有促進貓尾草莖粗的作用。

表2 菌株組合篩選結果Table 2 Result of strain combination screening

“+”表示菌株間無拮抗關系。

“+”means that there is noantagonistic relationship between different strains.

表3 PGPR菌株對病原菌的抑制效果Table 3 Inhibition effect of bio-control PGPR against pathogen

圖1 生物菌肥對小黑麥、貓尾草株高的影響Fig. 1 Effect of biological fertilizer on plant height of ×Triticale Wittmack and Uraria crinita

不同小寫字母表示不同施肥處理間差異顯著(P<0.05)。NF1,宿主植物菌肥；NF2，非宿主復合菌肥。下同。

Different lowercase letters indicate significant difference under different fertilization treatmentsat at the 0.05 levels; NF1, host plant bio-fertilizer; NF2, Non-host compound bio-fertilizer; similarly for the following figures and tables.

圖2 生物菌肥對小黑麥、貓尾草莖粗的影響Fig. 2 Effect of biological fertilizer on stem diameter of ×Triticale Wittmack and Uraria crinita

2.4 生物菌肥對小黑麥和貓尾草葉綠素含量的影響

與不施肥(CK)相比，各施肥處理對小黑麥、貓尾草葉綠素含量沒有顯著性影響(P>0.05)，試驗處理并沒有引起小黑麥葉綠素含量的顯著改變。各施肥處理對貓尾草葉綠素含量的影響總體表現(xiàn)為NF2>CK>化肥>NF1，與NF1相比NF2可使貓尾草葉綠素含量增加13.72%(圖3)。

2.5 生物菌肥對小黑麥和貓尾草生物量的影響

與不施肥(CK)相比，生物菌肥及化肥處理均能提高小黑麥地上生物量鮮重(圖4)，NF1處理對小黑麥地上鮮重具有顯著性影響(P<0.05)，與其余不同施肥處理對小黑麥地上鮮重間沒有顯著性影響(P>0.05)，總體表現(xiàn)為NF1>NF2>化肥>CK，且NF1與NF2相比小黑麥地上生物量鮮重增加0.89%；與不施肥(CK)相比，不同施肥處理對小黑麥地上生物量干重、地下生物量鮮重和干鮮重均沒有顯著性差異(P>0.05)，且不同施肥處理間也沒有顯著性差異(P>0.05)。不同施肥處理對貓尾草地上、地下生物量干鮮重的影響與小黑麥基本保持一致。

圖3 生物菌肥對小黑麥、貓尾草葉綠素含量的影響Fig. 3 Effect of biological fertilizer on chlorophyll content of ×Triticale Wittmack and Uraria crinita

圖4 生物菌肥對小黑麥、貓尾草生物量的影響Fig. 4 Effect of biological fertilizer on the biomass of ×Triticale Wittmack and Uraria crinita

2.6 生物菌肥對小黑麥和貓尾草根系形態(tài)的影響

不同施肥處理對小黑麥根系形態(tài)的影響總體表現(xiàn)為NF2>化肥>NF1>CK，對根平均直徑和根體積影響除外(表4)。與不施肥(CK)相比，NF1、NF2和化肥處理對小黑麥總根長、根表面積均沒有顯著影響(P>0.05)，NF2處理和化肥對根平均直徑和根體積影響顯著(P<0.05)，其中NF2處理的總根長、根表面積、根體積最大，分別為217.94 cm、11.78 cm2、0.35 cm3，與CK相比分別增加了27.54%、8.97%、118.75%。

與不施肥(CK)相比，NF1、NF2和化肥處理對貓尾草根系總根長、根表面積、根體積均沒有顯著性差異(P>0.05)，NF1處理對根平均直徑影響顯著(P<0.05)，即生物菌肥NF1對貓尾草根生長有一定的抑制作用，影響根的平均直徑(表5)。

2.7 生物菌肥對小黑麥和貓尾草不同根直徑下的總根長影響

與不施肥(CK)相比，NF2和化肥處理對小黑麥根直徑0.5～1.0、1.0～1.5 mm的根長有顯著影響(P<0.05)，NF1、NF2和化肥處理對>1.5 mm根長沒有顯著影響(P>0.05)；NF1處理對0～0.5 mm根長具有抑制作用。綜上可見，NF2處理與NF1處理相比，NF2處理對小黑麥細根的總根長影響較大(表6)。

表4 生物菌肥對小黑麥根系形態(tài)的影響Table 4 Effect of biofertilizer on root morphology of ×Triticale Wittmack

表5 生物菌肥對貓尾草根系形態(tài)的影響Table 5 Effect of biofertilizer on root morphology of Uraria crinita

表6 生物菌肥對小黑麥不同根直徑下的總根長影響Table 6 Effect of biofertilizer on total root length of different root diameter of ×Triticale Wittmack cm

4個處理對貓尾草根直徑0～0.5、0.5～1.0、0.5～1.0、>1.5 mm的根長均沒有顯著性差異(P>0.05)，但NF2處理對>1.5 mm根長影響最大。故生物菌肥對根系的生長具有明顯影響(表7)。

表7 生物菌肥對貓尾草不同根直徑下的總根長影響Table 7 Effect of biofertilizer on total root length of different root diameter of Uraria crinita cm

3 討論

在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中，施用生物菌肥對不同植物株高、莖粗、生物量、葉綠素含量、根系形態(tài)、抗病性等方面均有不同程度影響，且表現(xiàn)出化學肥料所沒有的優(yōu)勢。有研究表明,PGPR菌株接種宿主植物黃瓜(Cuoumissativus)、玉米(Zeamays)的株高和鮮重可分別提高8.63%～11.39%和6.3%～10.1%[20-21]。而將PGPR菌接種到非宿主植物，紫花苜蓿和蠶豆(Viciafaba)株高可提高65.37%～65.50%[22-23]，馬鈴薯(Solamumtubenxum)和蠶豆植物量提高17.91%～37.69%，蠶豆側根和毛根分別提高22.54%～23.77%和0.96%～5.87%[23]，桂花(Osmanthusfragrans)苗葉綠素含量增加9.85%[24]。本研究結果表明,施用非宿主植物菌肥(NF2)后，小黑麥毛細根、貓尾草莖粗均有增加，小黑麥、貓尾草地上生物量鮮重增加33.4%和38.41%。黃瓜施用PGPR菌肥后株高和鮮重分別提高11.39%和8.63%[20]，本研究結果與秦士嬌等[20]研究相比效果較好。然而植物養(yǎng)分吸收更依賴根長和根表面積而不是總根生物量[25]，可能是因為菌肥(NF2)中含有巴西固氮螺菌(Azopsirillumbrasilense)和短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)，能夠快速定殖且分泌植物激素，刺激禾本科毛細根生長，分蘗數(shù)增加，而根的增加可使植物從土壤中吸收更多的水分和營養(yǎng)，以支持植株生長，增加植物量[26]。本研究表明，施用菌肥NF2后，小黑麥葉綠素含量NF2比CK低1.29%，貓尾草葉綠素含量比CK提高9.60%。葉綠素含量與氮素營養(yǎng)吸收有關,豆科植物貓尾草自身特性決定吸收氮素較多，且NF2中的乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)定殖能力在貓尾草上較差，而在小黑麥上較強，因此貓尾草葉綠素含量上升而小黑麥葉綠素含量下降[27]。然而施用NF2后會顯著減小貓尾草的株高，使其減少24.86%。韓光等[22]施用復合型PGPR菌肥后，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿(非宿主植物)株高可提高65.37%～65.50%，其結果與本研究相反，造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于貓尾草根系分泌物影響到PGPR菌的定殖，從而影響植株對養(yǎng)分的吸收，造成貓尾草株高的減小。

總之，本研究結果表明，PGPR菌肥能夠促進非宿主植物的生長，影響植物的株高、莖粗、植物量、葉綠素含量、根系形態(tài)，但具體促生機理還有待進一步研究。

4 結論

本研究篩選出的適合小黑麥和貓尾草的菌株最佳組合為NCRP2+PPRS3+G+ZKRP2。小黑麥、貓尾草地上生物量鮮重在NF2處理、NF1處理、化肥處理下差異不顯著，但與CK處理相比差異顯著(P<0.05)，且NF2處理與CK相比分別增加22.35%和52.52%。與對照CK相比，施用菌肥NF2，小黑麥根平均直徑、根體積分別增加22.54%和118.75%，且差異顯著(P<0.05)；且NF2處理對直徑0.5～1.0和1.0～1.5 mm小黑麥根長影響顯著(P<0.05)。新制作的非宿主植物菌肥對小黑麥和貓尾草生長具有促進作用。