段海明，余 利，梁海申，黃偉東，余海兵

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,安徽鳳陽 233100)

葡萄白腐病是葡萄生產(chǎn)上的四大重要病害之一，一般年份造成葡萄產(chǎn)量損失達(dá)10%～50%，嚴(yán)重年份高達(dá)80%以上，甚至絕收。葡萄白腐病主要危害果穗、其次是新梢和葉片等[1]。該病害由白腐墊殼孢(Conielladiplodiella)引起，病原菌隨病殘?bào)w落入土壤中越冬，成為第2年的初侵染來源，病菌在套袋之前侵入果實(shí)，常造成大量落果腐爛，造成重大損失[2]。

目前，葡萄白腐病防治的報(bào)道以化學(xué)防治和生物防治為主。傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌劑由于使用方便、價(jià)格低廉等因素在國內(nèi)推廣面積大，使用者容易接受，然而大多數(shù)殺菌劑卻面臨抗藥性增強(qiáng)、農(nóng)藥殘留加劇，甚至造成農(nóng)業(yè)面源污染等問題，化學(xué)藥劑要減量使用在全社會(huì)已形成廣泛共識(shí)，但殺菌劑減量用藥的前提是防治效果不下降，所以尋找經(jīng)濟(jì)有效的化學(xué)殺菌劑減量增效方法已成為中國當(dāng)今植物病害防控的重大戰(zhàn)略需求[3-4]。綠色防治技術(shù)正日益興起，利用自然界中分布最廣泛的微生物開發(fā)環(huán)保、無公害的生防制劑來進(jìn)行有效的生物防治，從而逐步降低化學(xué)農(nóng)藥的使用量，使葡萄品質(zhì)提升，符合當(dāng)前農(nóng)藥減量使用和綠色防控的要求[5-6]。對葡萄白腐病具有拮抗作用的有真菌、放線菌和細(xì)菌等生防菌，拮抗菌對葡萄白腐病菌以室內(nèi)抑制效應(yīng)研究為主，田間推廣使用的還未見報(bào)道，主要是由于篩選到的生防菌的抑制活性尚未達(dá)到大規(guī)模推廣應(yīng)用要求。因此，還需要持續(xù)篩選出對葡萄白腐病菌具有更高抑制作用的拮抗菌供生產(chǎn)上使用[7-9]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)gfj-4分離自罹病番茄果實(shí)，于2014年9月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC NO:M 2014444)，已獲授權(quán)國家發(fā)明專利[10]。經(jīng)前期對峙培養(yǎng)法證明該菌株對葡萄白腐病菌具有較強(qiáng)的抑制活性，但生防菌直接使用受外界環(huán)境的影響較大，發(fā)酵代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用更接近生產(chǎn)實(shí)際。因此，本研究測定種子液培養(yǎng)時(shí)間、不同發(fā)酵時(shí)間對解淀粉芽孢桿菌gfj-4產(chǎn)發(fā)酵上清液抑菌活性的影響，以及發(fā)酵上清液、脂肽類粗提物對葡萄白腐病菌的抑制活性。在此基礎(chǔ)上，為擴(kuò)大該生防菌代謝產(chǎn)物的利用價(jià)值，測定生防菌產(chǎn)發(fā)酵上清液和7種化學(xué)殺菌劑混配組合對葡萄白腐病菌的抑制效應(yīng)，以期為化學(xué)殺菌劑的減量化使用和葡萄白腐病的防控提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試殺菌劑 95%苯醚甲環(huán)唑原藥、96%腈菌唑原藥和96%戊唑醇原藥由山東億嘉農(nóng)化有限公司、山東聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限化司和山東華陽農(nóng)藥化工有限公司提供；50%福美雙可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑、75%代森錳鋅可濕性粉劑、70%丙森鋅可濕性粉劑分別由南通寶葉化工有限公司、山東大成農(nóng)藥股份有限公司、拜耳作物科學(xué)有限公司和上海禾本藥業(yè)有限公司提供。殺菌劑原藥采用丙酮溶解，配制成1.0×104μg/mL 的母液置4 ℃冰箱保存，備用；制劑用滅菌水溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.2 供試菌株 葡萄白腐病菌(C.diplodiella)分離純化自安徽省鳳陽縣郊區(qū)葡萄白腐病典型發(fā)病果穗，并進(jìn)行分離純培養(yǎng)和鑒定。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖18.0 g，瓊脂15.0 g，去離子水1 L。

NA培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸膏3.0 g，酵母膏1.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂15.0 g，pH 7.0 (可不加瓊脂制成NB培養(yǎng)基)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌gfj-4不同菌齡對菌株產(chǎn)發(fā)酵上清液抑制葡萄白腐病菌的活性測定 解淀粉芽孢桿菌gfj-4在NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)48 h，挑取單菌落菌苔轉(zhuǎn)接入NB液體培養(yǎng)基中，33 ℃、120 r/min 搖培12 h，然后以φ=10% 的接種量接種到NB培養(yǎng)基中，于33 ℃、120 r/min分別培養(yǎng)4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和14 h，培養(yǎng)結(jié)束在11 180 g、4 ℃下離心10 min得菌體，用滅菌水調(diào)節(jié)菌懸液OD600=1.0作為種子液，以φ=0.5%的接種量接種到100 mL NB培養(yǎng)基中，然后置于33 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h，然后在11 180 g、4 ℃ 下離心20 min獲取發(fā)酵上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后保存于4 ℃冰箱，備用。采用菌絲生長速率法測定發(fā)酵上清液20倍稀釋液對葡萄白腐病菌的抑制率，接種結(jié)束后置于27 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每質(zhì)量濃度處理3皿，重復(fù)3次，采用十字交叉法測量菌落直徑，求出不同菌齡菌株產(chǎn)生的發(fā)酵上清液對病菌的抑制率[11]。

1.2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對菌株gfj-4發(fā)酵上清液抑制葡萄白腐病菌的活性測定 獲取種子液后以φ=0.5% 的接種量接入到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，分別搖培24 h、48 h、60 h、72 h、84 h和96 h，然后在11 180 g、4 ℃ 下離心20 min，獲取發(fā)酵上清液后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后保存于4 ℃冰箱，備用。按照“1.2.1”的方法求出不同培養(yǎng)時(shí)間制得的發(fā)酵上清液20倍稀釋液對葡萄白腐病菌的抑制率。

1.2.3 不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液對葡萄白腐病菌的抑制活性測定 將發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為72 h制得的發(fā)酵上清液按一定比例與冷卻到50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基充分混勻，使得發(fā)酵上清液在PDA培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)分別為6.7、8.3、12.5、16.7和33.3 μL/mL，按照“1.2.1”的方法測定不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液對葡萄白腐病菌的抑制活性，利用SPSS 13.0軟件計(jì)算發(fā)酵上清液對葡萄白腐病菌的EC50。

1.2.4 脂肽粗提物的制備及抑制活性測定 將培養(yǎng)72 h制得的發(fā)酵上清液用7 mol/L鹽酸調(diào)至pH=2，然后分裝到離心管中，每管8 mL，過夜沉淀后在11 180 g、4 ℃下離心20 min，去上清液，向每管沉淀中加入0.5 mL甲醇萃取8 h，然后在11 180 g、4 ℃下離心20 min，取上清液。采取同樣的方法再萃取2次，合并3次上清液保存于4 ℃冰箱，備用[12]。制得的脂肽粗提物按一定比例與冷卻到50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基充分混勻，使得脂肽粗提物的體積分?jǐn)?shù)分別為1.0、2.0、4.0、8.0和 16.0 μL/mL，按照“1.2.1”的方法測定脂肽粗提物對葡萄白腐病菌的抑制活性，計(jì)算脂肽粗提液對葡萄白腐病菌的EC50。

1.2.5 7種化學(xué)殺菌劑對葡萄白腐病菌的室內(nèi)毒力測定 測定苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑、戊唑醇、福美雙、百菌清、丙森鋅和代森錳鋅7種化學(xué)殺菌劑對葡萄白腐病菌的抑制活性(表1)。接種完畢后置于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，用十字交叉法測量菌落直徑。采用SPSS 13.0軟件求出7種化學(xué)殺菌劑對病菌的毒力回歸方程、EC50值、95%置信區(qū)間和R2。

表1 7種化學(xué)殺菌劑質(zhì)量濃度設(shè)置Table 1 Mass concentration gradient of 7 fungicides

1.2.6 殺菌劑新型混劑的毒性比測定 采用陳福良等[13]的方法設(shè)計(jì)菌株gfj-4發(fā)酵上清液和化學(xué)殺菌劑的混配試驗(yàn)，以發(fā)酵上清液和不同化學(xué)殺菌劑對葡萄白腐病菌的EC50為基礎(chǔ)，按其EC50值劑量的比例分別設(shè)置0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4，7∶3、8∶2、9∶1、10∶0共11個(gè)配比(體積比)，以不加藥劑處理為對照，采用菌絲生長速率法測定各配比的抑菌率和毒性比。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間的種子液對解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

由圖1可見，隨著菌株gfj-4種子液培養(yǎng)時(shí)間的增加，生防菌所產(chǎn)發(fā)酵上清液對葡萄白腐病的抑制率逐漸降低。培養(yǎng)時(shí)間為4 h制得的發(fā)酵上清液對病菌的抑制率最大，為92.9%(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步增加，菌株所產(chǎn)發(fā)酵上清液對病菌的抑制率逐步下降，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為14 h時(shí)抑制率下降至75.7%。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間的種子液對菌株gfj-4發(fā)酵上清液抑菌活性的影響Fig.1 Effects of seed broth at different =culture time on antifungal activity of strain gfj-4 fermentation supernatant

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對菌株gfj-4產(chǎn)發(fā)酵上清液抑制葡萄白腐病菌的影響

由圖2可見，隨著菌株gfj-4發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的增加，發(fā)酵代謝活性物質(zhì)對葡萄白腐病菌的抑制率先升高后降低。培養(yǎng)時(shí)間為84 h制得的發(fā)酵上清液的20倍稀釋液對病菌的抑制率最大為96.1%(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長，所產(chǎn)發(fā)酵上清液對病菌的抑制率下降，培養(yǎng)時(shí)間為96 h時(shí)抑制率下降至88.5%。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間對菌株gfj-4發(fā)酵上清液抑菌活性的影響Fig.2 Effects of different culture time on antifungal activity of strain gfj-4 fermentation supernatant

2.3 不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液對葡萄白腐病菌的抑制活性

由表2可知，解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液的體積分?jǐn)?shù)從6.7 μL/mL增至33.3 μL/mL，其對葡萄白腐病菌的抑制率從16.7%增至90.0%。經(jīng)SPSS 13.0軟件分析得出發(fā)酵上清液對葡萄白腐病菌的EC50為11.10 μL/mL(R2=0.95)。經(jīng)解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液處理的葡萄白腐病菌菌絲擴(kuò)展緩慢，生長稀疏(圖3)。

表2 不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液對葡萄白腐病菌的抑制率Table 2 Inhibition rate of different dilution ratios of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant to C.diplodiella

2.4 不同稀釋倍數(shù)的脂肽粗提物對葡萄白腐病菌的抑制活性

由表3可知，脂肽粗提物的體積分?jǐn)?shù)從1.0 μL/mL 增至16.0 μL/mL，其對葡萄白腐病菌的抑制率從6.3%增至98.0%，經(jīng)SPSS13.0軟件分析得出脂肽粗提物對葡萄白腐病菌的EC50為3.02 μL/mL (R2=0.96)。與對照相比可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)解淀粉芽孢桿菌脂肽粗提物處理的葡萄白腐病菌絲擴(kuò)展緩慢，高濃度發(fā)酵脂肽粗提物處理可使菌絲顏色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色，邊緣生長不規(guī)則，高濃度發(fā)酵上清液對病菌的抑制效果較好(圖4)。

A.對照 Control；B、C、D、E、F.分別為菌株gfj-4發(fā)酵上清液稀釋30、60、80、120和150倍 B, C, D, E, F are fermentation supernatant of strain gfj-4 diluted 30, 60, 80, 120 and 150 times, respectively

2.5 7種化學(xué)殺菌劑對葡萄白腐病菌的抑制活性

由表4可知，葡萄白腐病菌對麥角甾醇生物合成抑制劑苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑和戊唑醇的敏感性較高。其中，苯醚甲環(huán)唑?qū)ζ咸寻赘【囊种苹钚宰罡?，EC50為0.02 μg/mL；其次為腈菌唑和戊唑醇，它們對病菌的EC50分別為0.03 μg/mL和0.04 μg/mL。保護(hù)性殺菌劑福美雙和百菌清對病菌的EC50分別為2.81 μg/mL 和3.51 μg/mL，而丙森鋅和代森錳鋅對病菌的室內(nèi)抑制活性較差，EC50分別為23.72和33.43 μg/mL。

2.6 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與化學(xué)殺菌劑復(fù)配組合的毒性比

由表5～7可見，解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液與苯醚甲環(huán)唑和腈菌唑復(fù)配對葡萄白腐病菌的抑制活性表現(xiàn)為增效作用，其中與苯醚甲環(huán)唑以3∶7的體積比混配毒性比最高，達(dá)1.60；發(fā)酵上清液與腈菌唑以2∶8的體積比混配毒性比最高，為1.49。發(fā)酵上清液和戊唑醇混配既有增效作用也有拮抗作用，以3∶7的體積比混配毒性比最高，為1.30。

A.對照 Control；B、C、D、E、F.分別為菌株gfj-4脂肽粗提物稀釋62.5、125、250、500和1 000倍 B, C, D, E, F were lipopeptide crude extract of strain gfj-4 diluted 62.5,125,250,500 and 1 000 times, respectively

表3 不同稀釋倍數(shù)的脂肽粗提物對葡萄白腐病菌的抑制率Table 3 Inhibition rate of different dilution ratios of lipopeptide crude extract to C.diplodiella

由表8 ～ 11可見，解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液和4種保護(hù)性殺菌劑復(fù)配對葡萄白腐病菌的抑制活性表現(xiàn)各異。發(fā)酵上清液與福美雙混配僅以5∶5體積比表現(xiàn)為相加作用，其余表現(xiàn)為拮抗作用；發(fā)酵上清液與百菌清混配主要表現(xiàn)為相加作用；發(fā)酵上清液與丙森鋅混配主要表現(xiàn)為拮抗作用；發(fā)酵上清液與代森錳鋅不同的配比分別表現(xiàn)為相加和增效作用，其中以1∶9體積比混配毒性比最高，達(dá)1.25。

表4 7種化學(xué)殺菌劑對葡萄白腐病菌的毒力測定Table 4 Toxicity levels of 7 chemical fungicides to C.diplodiella

表5 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與苯醚甲環(huán)唑復(fù)配對葡萄白腐病菌的毒性比Table 5 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and difenoconazole to C.diplodiella

表6 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與腈菌唑復(fù)配對葡萄白腐病菌的毒性比Table 6 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and myclobutanil to C.diplodiella

表7 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與戊唑醇復(fù)配對葡萄白腐病菌的毒性比Table 7 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and tebuconazole to C.diplodiella

表8 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與福美雙復(fù)配對葡萄白腐病菌的毒性比Table 8 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and thiram to C.diplodiella

表9 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與百菌清復(fù)配對葡萄白腐病菌的毒性比Table 9 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and chlorothalonil to C.diplodiella

表10 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與丙森鋅復(fù)配對葡萄白腐病菌的毒性比Table 10 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and propineb to C.diplodiella

表11 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與代森錳鋅復(fù)配對葡萄白腐病菌的毒性比Table 11 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and mancozeb to C.diplodiella

3 討 論

中國葡萄的主栽品種對白腐病普遍缺乏抗性，而且病菌分生孢子器產(chǎn)生的快而多，分生孢子器能夠和病殘?bào)w在土壤中腐生，抗逆力極強(qiáng)，所以開展其高效生物防治技術(shù)研究尤為迫切[14]。生防菌產(chǎn)發(fā)酵液活性物質(zhì)和活體菌劑相比對外界環(huán)境條件的耐受性高，開展其對葡萄白腐病菌的抑制活性研究具有更大的實(shí)踐意義[15]。郭正彥等[16]分離一株放線菌A2C產(chǎn)發(fā)酵液的10倍稀釋液對葡萄白腐病菌的抑制率達(dá)100%；尹向田等[17]從土壤中分離到一株對葡萄白腐病菌有強(qiáng)烈抑制作用的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)，其無菌發(fā)酵液稀釋20倍對菌絲的抑制率為96.8%。郝雙紅等[18]報(bào)道一株側(cè)柏內(nèi)生菌異莖點(diǎn)霉屬(Paraphoma)真菌G21發(fā)酵液的10倍稀釋液對葡萄白腐病菌的抑制率大于90%，EC50為73.5 μL/mL；葛平華等[19]以菌絲生長速率法測定解淀粉芽孢桿菌GM-1菌株發(fā)酵液的26倍稀釋液對葡萄白腐病菌的抑制率達(dá)87.13%；于曉麗等[20]從西洋參根部分離獲得解淀粉芽孢桿菌YTB1407對葡萄白腐病菌具有較好的拮抗效果，采用對峙培養(yǎng)法獲得抑菌帶為8.75 mm。本研究所涉及的解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵上清液對葡萄白腐病菌的抑制效果較好，發(fā)酵上清液30倍稀釋液對葡萄白腐病菌的抑制率達(dá)90%，具有較大的潛在開發(fā)利用價(jià)值。生防菌一般田間應(yīng)用效果要差于化學(xué)殺菌劑，使用規(guī)模較小，葡萄白腐病的防治還以化學(xué)藥劑防治為主，關(guān)鍵在不降低藥效的基礎(chǔ)上，如何降低化學(xué)殺菌劑的使用量，從而降低農(nóng)藥殘留和對環(huán)境的污染[20-21]。從本研究可以看出，解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑、戊唑醇、代森錳鋅等藥劑部分配比在室內(nèi)表現(xiàn)較強(qiáng)的增效作用，在協(xié)同防治葡萄白腐病以及化學(xué)殺菌劑減量增效方面具有較高的潛在利用價(jià)值。從本研究還可以看出，從發(fā)酵上清液中提取的脂肽類物質(zhì)對葡萄白腐病菌具有較強(qiáng)的抑制效果，超過發(fā)酵液對病菌的抑制水平，但其田間防治效果還有待于進(jìn)一步得以驗(yàn)證。本研究可為葡萄白腐病的防治措施更新和研制新的生物農(nóng)藥和化學(xué)殺菌劑的復(fù)配劑提供技術(shù)依據(jù)。