劉 韜，吳麗軍，甘曉龍，張 波，劉寶龍，陳文杰，張連全，劉登才，張懷剛,4

(1.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所，西寧 810008； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 小麥研究所，成都 611130；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008)

小麥葉銹病(Wheat leaf rust)作為小麥的三大銹病之一，是由小麥葉銹菌(Pucciniatirticina)引起的真菌病害，影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)小麥生產(chǎn)具有極大威脅，嚴(yán)重爆發(fā)時(shí)減產(chǎn)50%[1-4]。研究培育小麥葉銹病抗病品種是小麥生產(chǎn)上最為經(jīng)濟(jì)和安全有效的方法。全面了解目前生產(chǎn)小麥品種的抗葉銹性及其所含有的抗葉銹基因、發(fā)掘新的葉銹病抗源已經(jīng)成為有效控制小麥葉銹病害的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

至今，國(guó)際上已發(fā)現(xiàn)抗小麥葉銹病基因超過(guò)100個(gè)，其中正式命名的有72個(gè)[5]。大部分已分子作圖并獲得緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記。Temam等[6]利用RILs定位14個(gè)小麥抗葉銹基因 Lr1、Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24、Lr27、Lr31、Lr32、Lr34、Lr35、Lr40、Lr46、Lr47，其中， Lr34、Lr35和 Lr46為成株抗性位點(diǎn)。Baszczyk等[7]對(duì) Lr9、Lr19、Lr20、Lr21、Lr24、Lr25、Lr26、Lr28、Lr29和 Lr37的分子標(biāo)記在小麥抗葉銹病育種中進(jìn)行有效驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)除 Lr21和 Lr25的分子標(biāo)記以外都具有高度特異性；Vida等[8]對(duì) Lr9、Lr24、Lr25、Lr29、Lr35和 Lr37的分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定，認(rèn)為這些分子標(biāo)記可以有效地檢測(cè)到未知背景的小麥品種所含有的抗葉銹病基因。 Lr9來(lái)源于小傘山羊草，對(duì)中國(guó)葉銹病優(yōu)勢(shì)小種表現(xiàn)極高的抗性，在生產(chǎn)上有很大利用價(jià)值[9]。

近年來(lái)，隨著全球氣候變化，青海也變得濕潤(rùn)多雨，成為小麥銹病的繁育地。而葉銹菌孢子對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)于條銹菌和稈銹菌孢子，既耐低溫也耐高溫。因此，葉銹病入侵青海并爆發(fā)將成為可能。2017年6月，中科院西北高原生物研究所張懷剛課題組在青海西寧周邊考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，西寧大通縣長(zhǎng)寧鎮(zhèn)(N36°49′，E101°45′)種植的部分小麥感染葉銹病(圖1)，不過(guò)未大規(guī)模爆發(fā)。所以了解青海當(dāng)?shù)貙彾ㄐ←溒贩N抗葉銹基因的分布狀況，通過(guò)基因聚合培育抗葉銹病品種非常迫切。

圖1 發(fā)現(xiàn)于青海西寧的葉銹病感病株葉片F(xiàn)ig.1 Wheat leaf rust detected in Xining,Qinghai province

本研究利用與6個(gè)抗葉銹基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)青海省審定的66個(gè)小麥品種進(jìn)行抗葉銹基因檢測(cè)，調(diào)查青海省當(dāng)?shù)仄胀ㄐ←溒贩N葉銹病抗性基因的分布情況，以期為小麥葉銹病抗病育種提供材料和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青海省審定的小麥品種66份(表1)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采集小麥新鮮葉片，在液氮中冷凍研磨后，用CTAB法[10]提取基因組DNA，用微量紫外檢測(cè)儀NANODROP2000C(Thermo)測(cè)量DNA質(zhì)量濃度。將DNA均稀釋到200 mg/L，用10 g/L的瓊脂糖膠在110 V電壓下電泳30 min，檢測(cè)DNA的質(zhì)量。

1.2.2 特異性引物的選擇 小麥抗葉銹病基因 Lr1[11]、 Lr9[12]、 Lr24[13]、 Lr29[14]、 Lr34[15]、 Lr42[16]是目前發(fā)現(xiàn)的能夠有效抵抗小麥葉銹病的抗性基因。上述基因已經(jīng)被分別定位到小麥染色體上： Lr1 定位到5DL[17]， Lr9 定位到6BL[17]， Lr24 定位到3DL[17]， Lr29 定位到7DS[17]， Lr34 定位到7DS[17]， Lr42 定位到1D[16]。根據(jù)查閱相關(guān)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、GrainGenes2.0(https://wheat.pw.usda.gov)、參考文獻(xiàn)得到與抗性基因相應(yīng)的引物序列22對(duì)，通過(guò)試驗(yàn)對(duì)比，選取穩(wěn)定性比較高的6對(duì)引物(表2)進(jìn)行相應(yīng)的抗性基因擴(kuò)增，各引物目的片段大小見(jiàn)表2。引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增以及電泳檢測(cè) 用6對(duì)引物對(duì)66份小麥品種的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。PCR擴(kuò)增體系(20 μL)為：10×Taqbuffer(200 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2) 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，2.5 U/μLTaqDNA polymerase 0.4 μL，各引物正反序列均為5 pmol，DNA 200 ng。PCR程序?yàn)椋?5 ℃變性4 min，然后35個(gè)循環(huán)95 ℃變性30 s，55 ℃～68 ℃復(fù)性(各引物根據(jù)試驗(yàn)前期摸索的最適退火溫度確定)30 s，72 ℃延伸30 s～1 min(根據(jù)目的片段大小確定)，最后72 ℃延伸10 min。不同的PCR產(chǎn)物根據(jù)各基因目的條帶大小，制作各自的瓊脂糖分離膠或PAGE膠；然后瓊脂糖膠在TAE緩沖液中，110 V電壓下，電泳30 min；取出后在凝膠成像儀中拍照保存。而PAGE膠在TBE緩沖液中，160 V電壓下，電泳2 h，將膠在置于含EB的TBE溶液(10 μL∶100 mL)中浸泡10 min，取出后在凝膠成像儀中拍照保存。

表1 66份青海省審定小麥品種Table 1 66 wheat cultivars released in Qinghai province

表2 微衛(wèi)星引物Table 2 SSR markers

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的篩選及最適退火溫度的確定

由于參考文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)中給出的引物有多對(duì)，最終篩選到最適合的6對(duì)引物和其最適退火溫度(表2)： Lr1的引物WR003，63 ℃； Lr9的引物J13，68 ℃； Lr24的引物S1302-609，55 ℃； Lr29的引物OPY10，60 ℃； Lr34的引物CSLV34，55 ℃； Lr42的引物Wmc432，55 ℃。

2.2 各抗性基因在普通小麥中的分布

分別用確定的6對(duì)引物及最適退火溫度對(duì)66份青海審定小麥品種分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，部分電泳圖如圖2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3)，在66份小麥品種中，有16份含有 Lr1，占24.24%；有18份含有 Lr24，占27.27%；有31份含有 Lr29，占46.97%；有5份含有 Lr34，占7.58%；有23份含有 Lr42，占34.85%。

在66份青海青海審定小麥品種中均未檢測(cè)出 Lr9抗性基因(表3)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)的小麥品種中同時(shí)含有2個(gè)抗性基因的品種有17份(表3)，占25.76%；同時(shí)含有3個(gè)或3個(gè)以上的品種有9份，占13.64%(表3)。綜上可以看出，同時(shí)含有多個(gè)抗葉銹病基因的品種很少，每個(gè)品種的抗葉銹病基因過(guò)于單一。

M1.1 kb plus DNA ladder；M2.50 bp DNA ladder；1-18.部分檢測(cè)樣品 Some detected samples

表3 66份青海審定小麥品種抗葉銹基因檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 Molecular detection results of leaf rust resistance genes in 66 wheat cultivars released in Qinghai province

(續(xù)表3 Continued table 3)

3 討 論

在中國(guó)，葉銹病發(fā)病地主要為長(zhǎng)江流域，多為西南和華東地區(qū)。但近年來(lái)，隨著全球氣候變暖，青海也變得濕潤(rùn)多雨，逐年成為小麥銹病的繁育地。葉銹病對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)于條銹病和稈銹病，既耐低溫也耐高溫。因此，葉銹病入侵青海并突然爆發(fā)將成為可能。2017年7月對(duì)西寧周邊區(qū)縣進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，在西寧大通縣長(zhǎng)寧鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)小麥葉銹病感病株(圖1)。雖后期未見(jiàn)該病在西寧周邊爆發(fā)，但這一現(xiàn)象足以說(shuō)明青海部分地區(qū)已逐漸滿足小麥葉銹病的發(fā)病條件。本研究以66份青海省審定的小麥品種為試驗(yàn)材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有10份材料不含有以上6種任何一種抗性基因，32份供試材料只含有其中1種抗性基因，研究結(jié)果表明：對(duì)青海省春小麥主栽品種‘阿勃’和‘高原448’[18]而言，‘高原448’不含以上6個(gè)抗葉銹病基因的任何一個(gè)，而‘阿勃’也只含有1個(gè)(表5)。這是一個(gè)危險(xiǎn)信號(hào)，一旦小麥葉銹病孢子的某小種適應(yīng)青海氣候環(huán)境，極有可能引起葉銹病在青海爆發(fā)，導(dǎo)致小麥減產(chǎn)和品質(zhì)下降。本研究也有不足之處，結(jié)論有可能不準(zhǔn)確，因?yàn)槟壳翱谷~銹病的基因還未完全發(fā)現(xiàn)，這些小麥品種中可能存在未曾檢測(cè)到的其他抗葉銹病基因。

本研究的另一結(jié)果表明，供試材料中含有的抗性基因極其單一，42份不含有或只含有1個(gè)抗性基因，占供試材料的63.64%。因此，引進(jìn)、發(fā)掘和合理利用優(yōu)良種質(zhì)資源，使一個(gè)品種同時(shí)聚合多個(gè)抗性基因，提高小麥抗性基因的多樣化，是防治小麥葉銹病的有效措施。

本研究明確了青海審定66份小麥品種的抗葉銹性及其抗葉銹基因的單一性等問(wèn)題，為小麥種質(zhì)的抗葉銹性評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)信息；同時(shí)，也為青海省的小麥抗病育種提供依據(jù)和材料。