蔣玲玉，黃慧麗，李秀波，徐 飛

(中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，國家飼料藥物基準實驗室，北京 100081)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是降低奶牛繁殖能力和生產(chǎn)性能的重要疾病之一[1]，發(fā)病率高，誘發(fā)母牛不孕癥，經(jīng)濟損失嚴重[2]。該病的主要病原菌為鏈球菌和葡萄球菌[3-5]，目前臨床上多采用抗生素治療，且主要以全身用藥為主。利福昔明(Rifaximin)是一種半合成的利福霉素類衍生物，抗菌譜廣，抗菌能力強[6]，對葡萄球菌和鏈球菌具有較好的活性[7]。且具有以下幾個優(yōu)點：①該藥作用迅速，臨床癥狀減退快。②該藥在體內(nèi)不易被吸收，局部使用可形成較高的血藥濃度，其他組織分布較少，不易產(chǎn)生動物性食品藥物殘留[8]。③安全性較好，無致畸性、致突變性、致癌性以及生殖毒性[9]。根據(jù)利福昔明的作用特點和在奶牛養(yǎng)殖業(yè)的需要，近年來利福昔明在獸醫(yī)臨床疾病(特別是奶牛疾病)的防治中也越來越受到關注。意大利FATRO公司研發(fā)生產(chǎn)的利福昔明子宮用產(chǎn)品，2010年以來，陸續(xù)在以色列、意大利、波蘭和捷克等國家批準上市，商品名為FATROXIMIN?，但目前該產(chǎn)品尚未在中國注冊。國內(nèi)，齊魯動物保健品有限公司于2014年批準了利福昔明乳房注入劑，商品名為齊利寧?[10]，目前我國尚沒有自己生產(chǎn)的利福昔明子宮注入劑。

為保障藥物的安全性和有效性，本研究建立了準確靈敏的利福昔明子宮注入劑HPLC含量測定方法并進行了不同檢測波長、流速及柱溫等色譜條件的耐用性試驗驗證其可靠性，最終對制劑中利福昔明的含量進行測定。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 高效液相色譜儀(Waters 2695)，美國Waters公司；數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電子分析天平，德國Sartorius公司；渦動裝置，美國Scientific industry公司；超純水裝置，美國Milli-Q公司；高速離心機，美國Thermo Fisher公司；手可調(diào)移液器，德國Eppendorf公司；酸度計(PB-21)，德國Sartorius公司；隔膜真空泵，天津市騰達過濾器件廠；溶劑微孔過濾膜(直徑47 mm，0.45 μm)，美國Pall公司；針筒式微孔濾膜過濾器(直徑13 mm，0.45μm)，天津博納艾杰爾科技有限公司；色譜柱(WondaSil C18-WR 250mm×4.6 mm，5 μm)，日本島津公司。奶牛用利福昔明子宮注入劑(含量187.5 mg/25 g/支)，中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所國家飼料藥物基準實驗室自主研發(fā)；利福昔明對照品(含量95.7%，批號130542-200601)，購自中國藥品生物制品檢定所；利福昔明原料藥(含量98.1%，批號80621-91-4)，購自浙江思賢制藥有限公司；乙腈、甲醇均為色譜級純，購自美國Fisher公司；甲酸銨、濃氨水均為色譜級純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 色譜條件 流動相：V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(3.16 g/L甲酸銨，濃氨水調(diào)pH至7.2)= 31.5∶31.5∶37；流速：1.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：276 nm。

1.3 樣品前處理 供試品工作液的配制：精密稱取搖勻后的利福昔明子宮注入劑4 g(相當于利福昔明30 mg)，精密加入乙腈30 mL，渦旋0.5 min，用錫紙封口，置于25 ℃超聲儀器中超聲30 min左右，4000 r/min離心5 min后精密取上清液5 mL，用流動相定容至50 mL，搖勻，即得100 μg/mL的供試品工作液。

對照品工作液的配制：精密稱取利福昔明對照品10.45 mg(相當于利福昔明10 mg)，將稱量的對照品轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，再用流動相溶解稀釋，定容，制備成100 μg/mL的對照品工作液。分別取適量并用流動相稀釋為40 μg/mL的工作液，進樣20 μL至液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。

1.4 參數(shù)考察和方法耐用性試驗 參照《中國獸藥典》，對線性范圍、靈敏度、準確度及精密度進行了考察，并對方法耐用性試驗進行研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品及對照品色譜圖 如圖1 所示。 供試品與對照品的保留時間分別為8.52 min和8.47 min，分離度分別為16.79和16.49，能與雜質(zhì)很好的分離，含量為98%，主峰尖銳且對稱。

2.2 線性范圍 精密稱取利福昔明對照品適量，用流動相配制成濃度分別為40、50、80、100、120、150 μg/mL的溶液。按1.2項下的色譜條件進樣，記錄色譜圖，按外標法計算利福昔明峰面積，以利福昔明峰面積為縱坐標(Y)，進樣濃度(X，μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，求出相關系數(shù)r=0.9995，結(jié)果表明利福昔明在40～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好。利福昔明標準曲線如圖2所示。

圖1 利福昔明色譜圖(a 對照品；b 供試品)Fig 1 Rifaximin chromatogram(a reference substance;b sample)

圖2 利福昔明標準曲線Fig 2 The calibration curve of rifaximin

2.3 靈敏度 采用逐步稀釋的方法，按信噪比S/N≥3計算，檢測限LOD值為0.25 μg/mL，按信噪比S/N≥10計算，定量限LOQ值為0.6 μg/mL。

2.4 準確度 取原料藥適量(187.5mg:152.90mg、187.5mg:191.13mg、187.5mg:229.36mg)，即按照利福昔明子宮注入劑處方以及濃度比例和原料藥的含量，理論上分別稱取152.90、191.13、229.36 mg，按照1.3項下所示方法配制成高、中、低三個濃度的樣品，即按照日內(nèi)測5次，日間測5次，平均回收率分別為99.88%、99.51%、99.59%，日間變異系數(shù)分別為0.6%、0.74%、0.7%。準確度(回收率)試驗結(jié)果如表1所示。

表1 準確度(回收率)試驗結(jié)果Tab 1 The result of accuracy(recovery)

2.5 精密度 精密稱取同一批樣品6份，按照1.3項下方法處理樣品，以1.2色譜條件進樣檢測，樣品含量峰面積平均值為993352.5，RSD=0.13%。精密度(重復性)試驗結(jié)果如表2所示。

表2 精密度(重復性)試驗結(jié)果Tab 2 The result of precision(repeatability)

2.6 耐用性試驗——檢測波長考察 參照《中國獸藥典》(2015年版)要求，對色譜條件進行耐用性試驗研究，設定變動范圍檢測波長為271～281 nm、流速0.8～1.7 mL/min、柱溫25～42 ℃，并設定梯度。取供試品及對照品適量，并配制成濃度為40 μg/mL的工作溶液，各取20 μL，按1.2項下色譜條件，依照表3改變檢測波長，連續(xù)進樣2針，在設定檢測波長275 nm上下波動，含量測定RSD為1.73%，無明顯影響，分離度符合要求，說明檢測波長在271～281 nm之間能準確的測定其含量。結(jié)果如表3所示。

2.7 耐用性試驗——檢測流速考察 取供試品及對照品適量并配制成濃度為40 μg/mL的工作溶液，色譜條件參照1.2項，在不同流速條件下，連續(xù)進樣2針，結(jié)果顯示，RSD=0.50%，對測定結(jié)果無明顯影響，分離度符合要求，說明檢測流速在0.8～1.6 mL/min之間能準確的測定其含量。檢測流速的考察結(jié)果如表4所示。

表3 檢測波長的考察結(jié)果Tab 3 The result of detection wavelength

表4 檢測流速的考察結(jié)果Tab 4 The result of flow rate

2.8 耐用性試驗——檢測柱溫考察 取供試品及對照品并稀釋成濃度為40 μg/mL的工作溶液，色譜條件參照1.2項，在不同柱溫條件下，連續(xù)進樣2針，結(jié)果顯示RSD=0.84%，對測定結(jié)果無明顯影響，分離度符合要求，說明檢測柱溫在25～40 ℃之間能準確的測定其含量(表5)。

表5 檢測柱溫的考察結(jié)果Tab 5 The result of column temperature

2.9 樣品含量測定 取利福昔明子宮注入劑三批(20141004，20141005，20141006)，按1.3項下方法配制供試品工作液，以1.2項色譜條件進樣檢測，3批樣品的含量分別為102.0%、99.8%、100.6%。

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品前處理方法的優(yōu)化 對樣品進行前處理的作用主要是除去樣品中的蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)，以避免大分子與利福昔明形成牢固的共價鍵而無法分開。目前，在很多化學藥物殘留檢測前處理方法中，使用有機酸溶液(如酸化乙腈、三氯乙酸)或純有機溶劑(如甲醇、乙腈)使蛋白質(zhì)變形可以除去樣品中的蛋白，然后加入正己烷等有機溶劑，除去脂肪物質(zhì)。

為了使提取效果最優(yōu)化，比較了乙腈、甲醇及流動相的提取效果，結(jié)果顯示，使用同為有機溶劑的乙腈與甲醇，后者的提取效果遠遠不如前者；乙腈和流動相相比，乙腈的回收率略高于流動相的10%，參照孫雷等[11]在樣品的前處理方法最終決定使用乙腈作為提取液。

3.2 耐用性試驗 耐用性是指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受其影響的承受程度，為所建立的方法用于日常檢驗提供依據(jù)。方法耐用性試驗是考察檢測方法可靠性的非常重要的內(nèi)容。在耐用性試驗研究中，第一次實驗，設流速梯度為0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min，RSD=3.48%，柱溫梯度為30、35、40、45 ℃，RSD=3.99%，故選擇將梯度設為流速上下浮動1 mL/min、柱溫上下浮動2 ℃，說明梯度變化過大對方法的穩(wěn)定性有一定的影響，因此，在實際含量測定過程中，這兩個高效液相色譜參數(shù)要特別注意，避免對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。

本文建立了HPLC法測定利福昔明子宮注入劑中主成分利福昔明的含量。結(jié)果表明，在40～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.9995)，檢測限(LOD)為0.25 μg/mL，定量限(LOQ)為0.6 μg/mL。以80、100、120 μg/mL三個濃度水平進行添加回收，回收率在98.26%～101.12%之間，日內(nèi)變異系數(shù)在0.17%～1.13%之間，日間變異系數(shù)<0.73%。耐用性研究表明，在測試范圍內(nèi)，檢測波長、流速、柱溫對含量測定無明顯影響(RSD<2.0%)且分離度符合要求。三批制劑樣品經(jīng)測定后，含量分別為102.0%、99.8%、100.6%。本研究建立的利福昔明子宮注入劑含量方法操作簡便、方法準確靈敏且可靠性高，可以用作該制劑的質(zhì)量控制。