董 青, 李 敏, 楊亦文, 鮑宗必, 楊啟煒, 張治國, 任其龍

(浙江大學化學工程與生物工程學院, 生物質化工教育部重點實驗室, 浙江 杭州 310027)

圖 1 EPA和DHA的結構式Fig. 1 Chemical structures of EPA and DHA

ω-3多不飽和脂肪酸是人體自身不能合成的必需脂肪酸[1],對人類健康的重要性自20世紀80年代就被大量報道。特別是源于深海魚油中的二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA),它們是ω-3多不飽和脂肪酸中的重要成員,結構式如圖1所示。大量流行病學和隨機試驗表明,它們在治療心腦血管疾病[2,3]、炎癥[4]、癌癥[5-7]、抑郁癥[8]、阿爾茨海默病[9]和促進嬰兒生長發(fā)育[10]等方面有著一定的功效。目前市場上已經有許多魚油膳食補充劑,還有治療高甘油三酯血癥(人體內甘油三酯水平大于或等于500 mg/dL)的ω-3魚油處方藥,如Lovaza[11](二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)含量46%、二十二碳六烯酸乙酯(DHA-EE)含量38%)、Vascepa[12](EPA-EE含量96%)、Epanova[13](EPA、DHA)。同時有許多研究[14,15]表明EPA和DHA的生理功能并不完全相同,因此需根據不同用途將兩者分離,但是EPA和DHA結構相似、容易發(fā)生氧化等變性反應,分離難度大。目前有低溫結晶法[16]、尿素包合法[17]、分子蒸餾法[18,19]、銀離子絡合法[20]、超臨界萃取法[21,22]、脂肪酶法[23]等可從魚油中富集EPA和DHA,但是這些方法很難將EPA與DHA分開;EPA與DHA的分離主要用色譜法[24-26],分離時EPA和DHA多以甲酯或者乙酯的形式存在。

20世紀60年代發(fā)展起來的模擬移動床(simulated moving bed, SMB)色譜技術,是連續(xù)化的制備色譜技術[27]。SMB分離具有產品純度和回收率高、固定相利用率高、溶劑消耗小、可自動控制等優(yōu)點,特別適合難分離兩組分體系的規(guī)?；苽鋄28]。SMB技術在分離EPA與DHA方面也有一些報道。宋磊等[29]以二次分子蒸餾得到的較高純度的魚油乙酯為原料,以C18柱為固定相,甲醇/水(95∶5, v/v)為流動相,運用六區(qū)串聯(lián)SMB工藝實現(xiàn)了EPA-EE、DHA-EE和雜質的3組分分離。Li等[30]在SMB上配置了8根C18柱,以甲醇洗脫EPA-EE和DHA-EE混合物,提取液中DHA-EE和提余液中EPA-EE的相對純度達到99%。

本文在前人的基礎上以PS/DVB聚合物為固定相,甲醇為洗脫劑,采用四區(qū)模擬移動床分離EPA-EE和DHA-EE;并對Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)流量、進料流量和進料濃度對分離的影響進行了探究,為工業(yè)化生產EPA-EE和DHA-EE單體提供實驗探究基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀(美國Waters公司); CSEP?C9116模擬移動床(德國KNAUER公司); GC-2010 plus氣相色譜儀(日本Shimadzu公司); Beckman Coulter LS13320粒度分布儀(美國庫爾特公司); SU-8010場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)。

EPA-EE(純度99%)、DHA-EE(純度95%)、高純度EPA-EE與DHA-EE混合物(純度≥95%,質量比1∶1)(蘇州仁普藥業(yè)有限公司); PS/DVB聚合物填料(蘇州納微科技有限公司);十七酸甲酯(純度>97%,日本TCI公司);甲醇(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);甲醇(色譜純,美國Tedia公司),乙醇(色譜純,德國Merck公司),乙腈(色譜純,美國Tedia公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1填料的表征

實驗中所用到的PS/DVB聚合物填料,用粒度測試儀測定粒徑分布,用掃描電子顯微鏡觀察球形度和粒徑分布。

1.2.2液相色譜脈沖進樣實驗和評價參數(shù)

液相色譜脈沖進樣實驗有兩個部分,其一是為SMB分離選擇合適的洗脫劑、填料粒徑和操作溫度,其二是測試8根半制備色譜柱(150 mm×10 mm, 20 μm)裝填的均一程度。

EPA-EE和DHA-EE混合物溶于甲醇中,配制成1.0 g/L的溶液,在PS/DVB聚合物色譜分析柱(150 mm×4.6 mm)上進樣并用甲醇洗脫;流動相流速1.0 mL/min,進樣量10 μL,檢測波長210 nm,用分離度RS來評價EPA-EE和DHA-EE分離的程度,從而確定較優(yōu)的選擇:

(1)

式中,tR,1和tR,2是兩組分的保留時間(min),w1和w2是兩組分的峰寬(min)。

尿嘧啶溶于甲醇,配制成0.1 g/L溶液,用于測定半制備色譜柱的總孔隙率εt。液相色譜操作條件為:流動相為甲醇;進樣量10 μL;柱溫40 ℃;檢測波長254 nm。在0.5 ～2.5 mL/min的流速下測定尿嘧啶在8根半制備色譜柱上的保留時間,扣除儀器死時間后得到柱死時間t0,根據公式(2)做出回歸直線,回歸直線斜率的數(shù)值就是色譜柱總孔隙率εt:

t0=εtL/u

(2)

式中,t0是色譜柱柱死時間(min),L是柱長(cm),u是表觀流速(cm/min)。

1.2.3模擬移動床實驗和評價參數(shù)

在德國KNAUER公司CSEP?C9116四區(qū)SMB上分離EPA-EE和DHA-EE混合物,操作步驟如下:(1)準確稱取一定量EPA-EE和DHA-EE混合物溶解于甲醇中,配成一定濃度的溶液,用0.45 μm的有機濾膜過濾后備用,準備足夠量洗脫劑備用;(2)將8根柱子(150 mm×10 mm)裝在SMB系統(tǒng)內,設置好切換時間10 min、溫度40 ℃，以及4個泵的流量,溫度達到設定值后開始實驗;(3)待SMB系統(tǒng)達到平衡時取樣,分別在提取液口和提余液口接一次完整切換時間的產品,分析產品組成。

在氣相色譜上采用內標法測定SMB兩出口產品的組成,內標物為十七酸甲酯。氣相色譜分析條件為:Agilent J&W HP-5非極性柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度250 ℃;柱溫220 ℃;氫火焰檢測器(FID)溫度280 ℃;進樣量1 μL;分流比1∶20。

SMB分離效果用純度、回收率、固定相生產率、溶劑消耗4個參數(shù)評價。

純度(%)為兩出口中目標組分的濃度與兩組分濃度和之比,是相對純度:

(3a)

(3b)

回收率(%)為目標組分的含量與原料液中該組分的比值:

(4a)

(4b)

固相相生產率(g/(L5h))為在單位時間內單位體積的固定相所能生產的兩目標產品的質量:

(5)

溶劑消耗(L/g)為生產單位質量的產品需消耗的溶劑體積:

(6)

上述式中A代表強吸附組分,B代表弱吸附組分。CEx,A、CRa,B分別是提取液和提余液中相應組分的質量濃度(g/L),QEx、QRa、QD、QF分別對應提取液出口流量、提余液出口流量、洗脫劑流量、原料進料流量(mL/min),Vcol是單根半制備色譜柱的體積(mL)。

2 結果與討論

2.1 聚合物色譜填料表征結果

填料粒徑均一、球形度良好在分析實驗和實際生產中都十分重要[31],單分散的球形填料可以減小壓降,便于放大后用于實際生產。圖2的粒徑分布圖表明,20 μm的粒徑呈現(xiàn)窄正態(tài)分布,測得的平均粒徑為19.19 μm;圖3的掃描電鏡圖表明,PS/DVB聚合物的球形度好,粒徑分布均一。因此本實驗選擇的PS/DVB聚合物色譜填料具有工業(yè)放大的良好前景。

圖 2 粒徑20 μm的PS/DVB聚合物粒徑分布圖Fig. 2 Particle diameter distribution of poly(styrene-co- divinylbenzene) (PS/DVB) (particle diameter 20 μm)

圖 3 粒徑20 μm的PS/DVB聚合物掃描電鏡圖Fig. 3 Scanning electron microscopy (SEM) images of PS/DVB polymer (particle diameter 20 μm)

2.2 流動相的選擇

在色譜分離中,固定相填料對樣品的分離具有重要影響,合適的流動相對改善分離效果有重要的輔助作用[32]。實際工業(yè)中確定流動相時,不僅需要考慮分離度,還要考慮成本、柱壓力降限制以及后續(xù)產品純化的難易程度,因而低黏度、低沸點的純溶劑是最佳的選擇。

圖 4 不同流動相洗脫EPA-EE和DHA-EE的流出曲線Fig. 4 Chromatograms of eicosapentaenoic acid ethyl ester (EPA-EE) and docosahexaenoic acid ethyl ester (DHA-EE) with different mobile phases Chromatographic column: (a, c, d) PS/DVB (150 mm×4.6 mm, 10 μm), (b) C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm); column temperature: 40 ℃; flow rate: 1.0 mL/min; injection volume: 10 μL; feed mass concentration: 1.0 g/L.

本實驗選擇了3種反相色譜常用的不同極性溶劑:甲醇、乙醇以及乙腈;探討這3種溶劑對EPA-EE和DHA-EE在PS/DVB色譜柱(150 mm×4.6 mm, 10 μm)上分離的影響,并與實驗室常用的C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)進行對比。圖4為洗脫的流出曲線,EPA-EE和DHA-EE的出峰順序由EPA-EE和DHA-EE純品的保留時間確定,4個譜圖中先流出的是弱保留組分EPA-EE,后流出的是強保留組分DHA-EE。

根據結果可知,3種流動相在PS/DVB柱上的洗脫強度依次為:乙腈>乙醇>甲醇；分離度依次為:甲醇>乙醇>乙腈。乙腈不能實現(xiàn)EPA-EE和DHA-EE的基線分離,而乙醇和甲醇均可以實現(xiàn)基線分離。乙醇為流動相時,EPA-EE和DHA-EE的分離度為1.83。甲醇在PS/DVB柱上的分離度達到2.75;而同樣條件下,實驗室常用的C18柱上的分離度僅為1.39?？紤]到甲醇較乙醇便宜,且甲醇的黏度小,可以減小壓降,沸點低更容易實現(xiàn)與產品分離,后續(xù)實驗均采用純甲醇為流動相。

2.3 粒徑的選擇

固定相填料的粒徑對分離影響很大。分別選取了粒徑為10、15、20、30、40 μm,孔徑均為10 nm的PS/DVB聚合物裝填在150 mm×4.6 mm柱子里,在溫度為40 ℃、甲醇為流動相、流速1.0 mL/min、上樣質量濃度1.0 g/L、上樣體積10 μL的條件下比較了粒徑對EPA-EE和DHA-EE分離的影響。EPA-EE和DHA-EE在不同粒徑色譜柱上的色譜圖如圖5所示,這5種粒徑的填料都能分離EPA-EE和DHA-EE的混合物。隨著固定相粒徑的增大,出峰時間提前,峰寬變寬,分離度減小。粒徑10 μm分離效果最好,分離度可達2.75。粒徑為15 μm時分離度為2.24,粒徑20 μm時分離度為1.86,均能達到基線分離。粒徑30 μm和40 μm則不能實現(xiàn)基線分離。因此,根據分離度,粒徑10 μm是最佳的選擇。

圖 5 在不同粒徑PS/DVB柱分離EPA-EE和 DHA-EE的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of EPA-EE and DHA-EE on PS/DVB columns with different particles diameters Chromatographic column: PS/DVB (150 mm×4.6 mm); mobile phase: methanol; column temperature: 40 ℃; flow rate: 1.0 mL/min; injection volume: 10 μL; feed mass concentration: 1.0 g/L.

在實際工業(yè)生產時,除了考慮分離度,柱壓降也是一個重要的參數(shù)。在液相色譜上測定了不同粒徑的PS/DVB填料的柱壓降,柱規(guī)格為150 mm×4.6 mm,流動相為甲醇,柱溫40 ℃。如圖6所示,粒徑10 μm的壓降最大;當粒徑增大到20 μm時,壓降與30 μm時的已十分接近。同時考慮到分離度的影響,在工業(yè)生產中可采用粒徑為20 μm的填料,在實驗室分析中可采用粒徑為10 μm的填料。

圖 6 不同粒徑PS/DVB的柱壓降Fig. 6 Pressure drop of PS/DVB columns with different particle diameters Chromatographic column: PS/DVB (150 mm×4.6 mm); mobile phase: methanol; column temperature: 40 ℃.

2.4 溫度的選擇

提高溫度可以縮短保留時間,對于分離度的影響則因分離物質不同而有所差別。在PS/DVB色譜柱(150 mm×4.6 mm, 10 μm)上測定了溫度對EPA-EE和DHA-EE分離的影響,流動相為甲醇,流速1.0 mL/min,進樣質量濃度1.0 g/L,進樣量10 μL。不同溫度下的流出曲線如圖7所示。在20～50 ℃范圍內,隨著溫度升高,EPA-EE和DHA-EE流出時間縮短,峰寬變窄,這說明隨著溫度增加,脫附速率加快,物質在色譜柱上停留時間變短。最重要的是,隨著溫度升高,分離度不斷增大,因此選擇較高的操作溫度對分離更有利,考慮到PS/DVB聚合物適宜的操作溫度在60 ℃以下,因此本實驗選擇40 ℃為較佳的操作溫度。

圖 7 不同溫度下EPA-EE和DHA-EE的流出曲線Fig. 7 Chromatograms of EPA-EE and DHA-EE at different temperatures Chromatographic column: PS/DVB (150 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phase: methanol; flow rate: 1.0 mL/min; injection volume: 10 μL; feed mass concentration: 1.0 g/L.

2.5 半制備色譜柱均一性的評價

10 μm的PS/DVB色譜填料雖然對EPA-EE和DHA-EE分離度高,但小粒徑的填料壓降較大。綜合考慮分離度和壓降,確定選用粒徑20 μm、孔徑10 nm的PS/DVB聚合物裝填了8根半制備柱(150 mm×10 mm)。SMB分離系統(tǒng)的穩(wěn)定運行要求8根色譜柱填裝均一、性能相近[33]。按照1.2.2節(jié)中方法測定8根PS/DVB聚合物半制備色譜柱的總孔隙率,平均值為0.698,相對偏差在1%以內,這說明色譜柱的裝填效果一致,不會影響SMB色譜系統(tǒng)運行的穩(wěn)定性。

2.6 模擬移動床分離實驗結果

根據上文對流動相種類、粒徑和溫度的考察結果,確定以甲醇為洗脫劑,操作溫度40 ℃,填料粒徑20 μm,在SMB色譜上分離EPA-EE和DHA-EE。3組不同條件的實驗結果如表1所示。A組考察Ⅱ、Ⅲ區(qū)流量對分離EPA-EE和DHA-EE的影響,B組考察進料流量對分離的影響,C組考察進料濃度對分離的影響。從液相色譜上保留順序可知,DHA-EE是強吸附組分,EPA-EE是弱吸附組分。因此在合適的操作參數(shù)下,DHA-EE從提取液口流出,EPA-EE從提余液口流出。

2.6.1Ⅱ、Ⅲ區(qū)流量對分離的影響

根據前人的研究[34],兩個相近組分的分離是在SMB的Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)完成的。在Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)流量滿足分離條件時,Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)的流量對EPA-EE和DHA-EE的分離有著至關重要的影響。A組實驗中保持進料流量不變,只改變Ⅱ區(qū)Q2的流量,Ⅲ區(qū)的流量Q3也會增加。當Ⅱ、Ⅲ區(qū)流量增加時,提取液中DHA-EE的相對純度緩慢增加,提余液中EPA-EE的相對純度則先緩慢下降后迅速下降。這是因為當Ⅱ、Ⅲ區(qū)流量增大時,EPA-EE和DHA-EE的濃度峰均向提余液口移動,導致提余液中EPA-EE的純度從93.8%下降到69.0%,提取液中DHA-EE的純度則從83.0%上升到95.9%。因Ⅱ、Ⅲ區(qū)流量變化對兩出口目標組分的純度有著相反的影響,當Ⅱ、Ⅲ區(qū)流量增大時,提取液出口DHA-EE的回收率不斷下降,提余液出口EPA-EE的回收率不斷增加。因此存在一組最合適的Ⅱ、Ⅲ區(qū)流量,在此流量下兩出口產品純度均較高、回收率高、固定相生產率大,同時溶劑消耗小。在本實驗流量變化范圍內,綜合考慮到產品純度和回收率,A3為最佳的操作點,此時固定相生產率最大,為5.97 g/(L5h);溶劑消耗最小,為1.52 L/g。

表 1 模擬移動床分離EPA-EE和DHA-EE的實驗結果

Q1,Q2,Q3,Q4,QF: flow rates of zones Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and feed;CF: feed mass concentration;PE: purity of extract;PR: purity of raffinate;YD: recovery of DHA-EE;YE: recovery of EPA-EE. Elution solvent: methanol; temperature: 40 ℃; switching time: 10 min.

2.6.2進料流量對分離的影響

加大進料流量可以提高SMB的處理能力,但過大的進料量會影響分離效果。在B組的實驗中,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ區(qū)流量均保持不變,進料流量從0.2 mL/min增加到0.5mL/min。加大進料流量,提取液出口DHA-EE的純度基本保持不變,提余液出口EPA-EE的純度則不斷下降,特別是當進料流速從0.3 mL/min增加到0.4 mL/min時,EPA-EE的純度從91.6%降到68.1%。這是因為進料流量QF增大,Ⅲ區(qū)流量也相應增大,EPA-EE和DHA-EE更多從提余液中流出,導致提余液中EPA-EE的純度急劇下降;而Ⅱ區(qū)流量沒有改變,提取液出口中DHA-EE的純度也就沒有太大變化。EPA-EE和DHA-EE的回收率與它們純度的變化趨勢相反。另一方面,增大進樣流量,固定相生產率不斷增加,溶劑消耗在減小,但是兩者變化的幅度趨于平緩?？紤]到純度和回收率是最主要的考察指標,因而B2對應的是此條件下的最佳進樣量,為0.3mL/min。

2.6.3進樣濃度對分離的影響

與增加進料流量一樣,提高進樣濃度可提高SMB的處理量,C組是不同進料濃度的實驗結果。進料濃度增加,提取液出口DHA-EE的純度略有上升,提余液出口EPA-EE的純度急劇下降;DHA-EE的回收率不斷下降,EPA-EE回收率基本不變。隨著進料濃度的增加,分離效果顯著變差,這表明EPA-EE和DHA-EE在PS/DVB聚合物上存在較強的非線性吸附效應。因此在同樣的操作條件下,只改變進樣濃度,對分離的結果影響很大,但是相應的固定相生產率增大,溶劑消耗減小。因此進料濃度改變后需相應調整SMB的參數(shù)才能保證較佳的分離效果。

3 結論

用PS/DVB聚合物分析色譜柱實現(xiàn)了EPA-EE和DHA-EE的完全分離。通過在分析柱上的優(yōu)化實驗,確定以粒徑20 μm的PS/DVB聚合物為SMB分離的填料,以甲醇為洗脫劑,操作溫度40 ℃。SMB實驗能夠成功制備較高純度的EPA-EE和DHA-EE單體,通過改變Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)的流量、進樣流速、進樣質量濃度,得到了較佳的分離效果。SMB分離EPA-EE和DHA-EE具有較大開發(fā)潛力。