羅紅艷，陳瀟瀟，石零珊，曹光球，林思祖，葉義全

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福州 350002；2 國(guó)家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心，福州 350002)

杉木(Cunninghamialanceolata)是中國(guó)南方重要的速生用材樹種之一，因其具有材質(zhì)優(yōu)良和速生豐產(chǎn)等特點(diǎn)被廣泛種植，在中國(guó)林業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位[1]。長(zhǎng)期林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐表明，鋁毒是中國(guó)南方富鐵鋁化酸性土壤中限制杉木生長(zhǎng)，導(dǎo)致杉木人工林產(chǎn)量下降的主要原因之一[2-3]。近年來(lái)，隨著肥料的不合理使用、杉木連栽代數(shù)的增加以及全球酸沉降的加劇，南方林地土壤的酸化程度進(jìn)一步加深[4-7]，從而極大地促進(jìn)土壤中活性鋁的釋放，導(dǎo)致土壤中活性鋁的含量顯著增加，使杉木遭受鋁毒害狀況日益加劇。因此，選育具有耐鋁能力的優(yōu)良杉木家系，充分挖掘優(yōu)良家系的遺傳潛力，提高杉木對(duì)鋁脅迫的耐性，是解決當(dāng)前林地土壤鋁毒害問(wèn)題的有效途徑之一，而探明杉木遭受鋁毒和耐鋁性的生理生化機(jī)制是開展杉木耐鋁品種選育和遺傳改良的基礎(chǔ)。盡管近年來(lái)已有部分學(xué)者對(duì)杉木鋁毒展開了研究，但大部分研究主要集中在鋁毒脅迫對(duì)杉木的生長(zhǎng)、養(yǎng)分吸收、有機(jī)酸分泌和SOD活性的影響等方面[3,8-13]，迄今對(duì)于杉木自身如何感知鋁脅迫，并作出響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。因此，開展杉木鋁毒脅迫耐性機(jī)制的研究，對(duì)于揭示杉木適應(yīng)鋁毒脅迫環(huán)境的生物學(xué)過(guò)程，并通過(guò)基因工程手段改良杉木耐鋁能力，改善酸性土壤中杉木的生長(zhǎng)，最終提高杉木人工林的產(chǎn)量具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。

鋁脅迫誘導(dǎo)的活性氧迸發(fā)及其介導(dǎo)的質(zhì)膜氧化損傷被認(rèn)為是鋁脅迫引起植物生長(zhǎng)受抑的主要原因之一[14]。正常情況下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于穩(wěn)態(tài)平衡狀態(tài)，對(duì)植物并無(wú)害處，甚至可以作為一種有益的信號(hào)分子廣泛參與植物各種生理過(guò)程的調(diào)控[15]。但在鋁脅迫條件下，植物體內(nèi)活性氧的大量迸發(fā)，會(huì)對(duì)質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和完整性造成嚴(yán)重破壞，從而引起氧化損傷，最終抑制植物對(duì)養(yǎng)分和水分的吸收[16]。植物為緩解鋁毒脅迫引起的氧化損傷，在長(zhǎng)期適應(yīng)鋁毒環(huán)境過(guò)程中進(jìn)化出一套由酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)組成的活性氧清除體系。抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(AsA-GSH)作為植物抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，在調(diào)控植物體內(nèi)活性氧水平，增強(qiáng)植物逆境脅迫耐性中扮演著重要角色[17-20]。目前關(guān)于AsA-GSH循環(huán)在鋁脅迫[17]、重金屬脅迫[18,20]、干旱脅迫[19]和低溫脅迫[21]等非生物脅迫中的作用已得到證實(shí)，而且越來(lái)越多研究證實(shí)AsA-GSH酶活性與植物逆境脅迫耐性密切相關(guān)[22-24]。盡管目前關(guān)于植物耐鋁機(jī)制的研究已有不少，但這些研究主要集中在農(nóng)作物中[22-24]，而對(duì)杉木耐鋁機(jī)制的研究較少[8]，特別是關(guān)于AsA-GSH循環(huán)在杉木耐鋁性中的作用尚未見研究報(bào)道。因此，本研究以耐鋁型(YX26)和鋁敏感型(YX5)杉木家系為試驗(yàn)材料，考察鋁脅迫對(duì)杉木葉片膜脂過(guò)氧化、抗氧化酶和AsA-GSH循環(huán)的影響，并進(jìn)一步分析不同耐鋁型杉木無(wú)性系對(duì)鋁脅迫響應(yīng)的差異，探討抗氧化酶系統(tǒng)與杉木耐鋁能力之間的相互關(guān)系，以期從AsA-GSH角度揭示杉木耐鋁機(jī)理，并為利用基因工程手段改良杉木耐鋁能力，改善酸性土壤上杉木的生長(zhǎng)，從而最終提高杉木人工林產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試杉木家系材料是由國(guó)家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心提供的YX5和YX26一年生杉木苗。本課題組在前期試驗(yàn)中對(duì)包括杉木家系YX5和YX26在內(nèi)的72個(gè)杉木家系進(jìn)行苗期耐鋁性的篩選，結(jié)果顯示，YX26較耐鋁，而YX5則對(duì)鋁較為敏感。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2016年4月中旬在福建農(nóng)林大學(xué)田間實(shí)驗(yàn)室溫室大棚進(jìn)行。統(tǒng)一選用盆口內(nèi)徑40 cm、底部?jī)?nèi)徑35 cm、高度33 cm的圓形塑料花盆開展盆栽試驗(yàn)，盆栽基質(zhì)為蛭石和珍珠巖(2∶1,V/V)混合物。選取長(zhǎng)勢(shì)(苗高、地徑)基本一致的1年生杉木家系YX5和YX26幼苗，先將其移栽入塑料花盆中緩苗10 d，每盆3株苗，緩苗結(jié)束后開始進(jìn)行鋁脅迫試驗(yàn)處理。本試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)處理，分別為對(duì)照(CK)和鋁脅迫(Al)，2個(gè)處理均設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)共4盆。試驗(yàn)處理中對(duì)照用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，鋁脅迫處理用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液再加AlCl3溶液澆灌，鋁濃度為1 mmol·L-1，營(yíng)養(yǎng)液pH均為4.5。試驗(yàn)期間每天定時(shí)向每盆中澆0.2 L相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)液1次，處理10 d后，用消毒處理的剪刀剪取杉木幼苗上部高度一致的當(dāng)年生枝條尖端的無(wú)病無(wú)斑、完全展開的新生葉，立即置于自封袋于液氮中速凍，并置于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

試驗(yàn)采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定杉木幼苗葉片丙二醛(MDA)的含量[25]。采用愈創(chuàng)木酚法[27-28]測(cè)定杉木幼苗葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)活性，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外線吸收法[26-27]測(cè)定。還原型抗壞血酸(AsA)、氧化型抗壞血酸(DHA)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量根據(jù)Logan等[28]和Aravind等[29]的方法測(cè)定?？箟难徇^(guò)氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性的測(cè)定參考Jiang等[30]的方法。單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)的含量測(cè)定參考Nakano等[31]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及繪圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，并用SPSS19.0軟件進(jìn)行LSD多重比較分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁脅迫對(duì)不同杉木家系幼苗葉片表型和MDA含量的影響

由圖1，A可以看出，鋁脅迫處理前后兩個(gè)家系杉木幼苗表型并未發(fā)生明顯變化，表明濃度1 mmol·L-1短期(10 d)鋁脅迫處理對(duì)杉木生長(zhǎng)表型沒有明顯的影響。MDA是植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量的高低通常用來(lái)表征細(xì)胞質(zhì)膜遭受氧化損傷程度的大小。如圖1，B所示，鋁脅迫顯著誘導(dǎo)MDA在兩杉木家系幼苗葉片中積累，且鋁脅迫下兩個(gè)杉木家系幼苗葉片MDA含量均顯著高于對(duì)照(P<0.05)，其中鋁敏感型家系YX5和耐鋁型家系YX26幼苗葉片中MDA含量分別較對(duì)照增加了55.28%和22.82%，說(shuō)明鋁脅迫下耐鋁型杉木家系葉片遭受的膜脂過(guò)氧化程度明顯小于鋁敏感型杉木家系YX5。

同一家系不同小寫字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著；下同。圖1 鋁脅迫下不同耐鋁型杉木家系幼苗表型及葉片丙二醛含量的變化Different normal letters of the same family indicate significant differences between different treatments at 0.05 level; The same as belowFig.1 The plant morphology and malondialdehyde content in leaves of C. lanceolata families with contrasting Al tolerance under Al stress

2.2 鋁脅迫對(duì)不同耐鋁型杉木家系幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

圖2，A顯示，與對(duì)照相比，鋁脅迫處理顯著降低敏感型杉木家系YX5葉片CAT活性(P<0.05)，而對(duì)耐鋁型杉木家系YX26葉片CAT活性則略有提高，且YX26活性顯著高于YX5，表明CAT活性在YX26中的表達(dá)屬于組成型，而在YX5中的表達(dá)屬于抑制型。同時(shí)，由圖2，B可知，與CAT活性變化趨勢(shì)類似，鋁脅迫下敏感型杉木家系YX5葉片SOD活性受到明顯抑制，其活性顯著低于對(duì)照(P<0.05)；盡管鋁脅迫下耐鋁型杉木家系YX26葉片SOD活性也表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但其活性與對(duì)照組差異并不顯著(P>0.05)。另外，與前兩個(gè)抗氧化酶酶活性變化趨勢(shì)不同，鋁脅迫下兩個(gè)杉木家系葉片中POD活性(圖2，C)均較對(duì)照有所增加，其中敏感型杉木家系YX5和耐鋁型杉木家系YX26葉片中POD活性分別較對(duì)照增加了14.96%和96.27%，且鋁處理下耐鋁型杉木家系葉片POD活性與對(duì)照相比差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。無(wú)論是對(duì)照還是鋁脅迫處理下，耐鋁型杉木家系YX26葉片中CAT和POD活性均高于鋁敏感型杉木家系YX5，而耐鋁型杉木家系YX26幼苗葉片中SOD活性均不同程度地低于鋁敏感型杉木家系YX5。

圖2 鋁脅迫下不同耐鋁型杉木家系幼苗葉片抗氧化酶活性的變化Fig.2 The antioxidant enzyme activities in leaves of C. lanceolata families with contrasting Al tolerance under Al stress

2.3 鋁脅迫對(duì)不同耐鋁型杉木家系幼苗葉片AsA-GSH循環(huán)非酶性抗氧化劑含量的影響

鋁脅迫條件下，兩個(gè)杉木家系葉片中AsA的含量均比相應(yīng)對(duì)照顯著增加(P<0.05)，其中敏感型杉木家系YX5和耐鋁型家系YX26葉片中AsA含量增幅分別達(dá)到62.36%和24.18%(圖3，A)。與AsA含量表現(xiàn)類似，鋁脅迫處理也顯著促進(jìn)GSH在杉木葉片中的積累，其中敏感型家系YX5和耐鋁型杉木家系YX26葉片GSH含量分別較對(duì)照增加了36.60%和703.93%(圖3，B)。與對(duì)照相比(圖3，C、D)，鋁脅迫下兩杉木家系葉片中DHA含量不存在顯著差異(P>0.05)，但鋁脅迫處理大幅顯著增加了兩個(gè)杉木家系葉片中GSSG的含量(P<0.05)，鋁敏感家系YX5和耐鋁家系YX26葉片中GSSG含量增幅分別為105.38%和135.68%。上述結(jié)果表明，鋁脅迫下兩個(gè)杉木家系葉片中非酶性抗氧化劑含量大多顯著增加，且耐性家系杉木YX26葉片中GSH、DHA和GSSG的含量增幅明顯高于敏感型家系YX5。

2.4 鋁脅迫對(duì)不同杉木家系幼苗葉片AsA-GSH循環(huán)酶活性的影響

鋁脅迫處理顯著增加了兩個(gè)杉木家系葉片APX活性(P<0.05)，其中鋁敏感型杉木家系YX5和耐鋁型杉木家系YX26葉片中APX活性較對(duì)照分別增加了16.41%和23.83%(圖4，A)。但是，與APX活性變化趨勢(shì)相反，鋁脅迫處理顯著抑制兩個(gè)杉木家系葉片GR活性(P<0.05)(圖4，B)。同時(shí)，由圖4，C可知，鋁敏感杉木家系幼苗葉片中MDAR活性在鋁脅迫下較對(duì)照增加了5.70%(P>0.05)，而耐鋁杉木家系YX26葉片中則顯著增加了8.66%(P<0.05)。另外，鋁脅迫對(duì)兩個(gè)杉木家系幼苗葉片DHAR活性變化具有不同的影響，其中鋁敏感杉木家系YX5葉片中DHAR活性較對(duì)照顯著降低了31.83%，而耐鋁杉木家系YX26葉片中則顯著增加了26.15%(圖4，D)。

圖3 鋁脅迫下不同耐鋁型杉木家系幼苗葉片AsA、GSH、DHA和GSSG含量的變化Fig.3 The contents of AsA, GSH, DHA and GSSG in leaves of C. lanceolata families with contrasting Al tolerance under Al stress

圖4 鋁脅迫下不同耐鋁型家系杉木幼苗葉片AsA-GSH循環(huán)酶活性的變化Fig.4 The enzyme activities of AsA-GSH cycle in leaves of C. lanceolata families with contrasting Al tolerance under Al stress

3 討 論

為減輕逆境脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷，維持細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，植物在長(zhǎng)期適應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中，進(jìn)化出一套由酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)組成的抗氧化體系，這些抗氧化體系在維持植物體內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài)平衡，緩解逆境脅迫引起的氧化損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[36]。SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其通過(guò)協(xié)同作用清除體內(nèi)活性氧保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。一般而言，逆境脅迫下植物抗氧化酶活性的變化與植物的種類、遭受脅迫的強(qiáng)度以及脅迫時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)[37]。本試驗(yàn)中鋁敏感型杉木家系YX5葉片CAT活性受到顯著抑制，盡管耐鋁杉木家系YX26在鋁脅迫下CAT活性變化并不顯著，但無(wú)論在正常還是在鋁脅迫下其CAT活性均高于敏感型杉木家系YX5，表明鋁脅迫下耐性杉木家系YX26組成型維持較高的CAT活性是其較耐受活性氧誘導(dǎo)的氧化損傷的可能原因之一。本試驗(yàn)還表明，鋁脅迫下不同耐鋁型家系杉木幼苗葉片SOD活性均出現(xiàn)下降，而且敏感型杉木家系YX5幼苗葉片中SOD活性下降幅度大于耐鋁型杉木家系YX26，這可能由于敏感型杉木家系自身對(duì)鋁脅迫的抵抗能力有限，高濃度和長(zhǎng)時(shí)間的鋁處理使其酶活性顯著降低。陳志剛等[38]研究也發(fā)現(xiàn)隨著鋁處理濃度的增加(當(dāng)鋁濃度超過(guò)100 mg·L-1時(shí))和處理時(shí)間的延長(zhǎng)(>8 h)，黑麥草(Lolium)根系SOD活性顯著降低。另外，本試驗(yàn)中鋁脅迫下不同杉木家系葉片POD活性均表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，且耐鋁型杉木家系YX26葉片POD活性顯著高于對(duì)照，表明鋁脅迫下耐性杉木家系增強(qiáng)了自身活性氧清除能力，這與鋁脅迫下不同耐鋁型栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)[39]和玉米[40]的POD活性變化規(guī)律一致。由此可見，與鋁敏感型杉木家系相比，鋁脅迫下耐鋁型杉木家系具有較高的保護(hù)酶活性，從而使其具有更強(qiáng)的活性氧清除能力，這可能是導(dǎo)致耐鋁型杉木家系YX26比敏感型杉木家系YX5更耐鋁脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷的原因之一，同時(shí)也表明抗氧化酶在杉木耐鋁性調(diào)控中扮演著關(guān)鍵角色。

除了常規(guī)的抗氧化酶SOD、POD和CAT外，AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶如APX、GR、DHAR和MDAR也是植物體內(nèi)活性氧清除的另一關(guān)鍵途徑[21-24]。在AsA-GSH循環(huán)中，APX主要利用AsA來(lái)清除H2O2，其對(duì)H2O2的親和性要遠(yuǎn)大于CAT；GR則主要催化GSSG還原為GSH，而GSH通過(guò)為H2O2提供電子供體將H2O2還原成水，同時(shí)GSH被氧化成GSSG；MDHA和MDHAR則主要介導(dǎo)AsA再生[41]。大量研究表明鋁在引起植物氧化損傷的同時(shí)，也能夠刺激植物AsA-GSH循環(huán)中相關(guān)酶活性的提高，增強(qiáng)植物對(duì)活性氧的清除能力[17,42-43]。本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)鋁脅迫下兩個(gè)杉木家系葉片APX活性均較對(duì)照顯著增加，表明鋁脅迫下杉木通過(guò)提高自身對(duì)H2O2清除的能力，從而減輕鋁脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。而且耐鋁型杉木家系YX26葉片APX活性增幅要高于敏感型杉木家系YX5，暗示鋁脅迫下耐鋁型杉木家系YX26葉片受到的氧化損傷小于鋁敏感型YX5，可能與其維持較高的APX活性，從而具有增強(qiáng)活性氧清除能力有關(guān)。與本研究結(jié)果類似，前期一些研究也表明鋁脅迫能顯著增加植物體內(nèi)APX活性[17,43-44]，可見鋁脅迫下APX活性的提高是植物應(yīng)答鋁脅迫的通用機(jī)制。GR是AsA-GSH循環(huán)另一關(guān)鍵酶，本試驗(yàn)中鋁脅迫下不同耐鋁型杉木家系幼苗葉片GR活性均顯著受到抑制，這可能由于GR對(duì)鋁脅迫較為敏感，高濃度或長(zhǎng)時(shí)間的鋁處理使其活性顯著受抑，這與李琲琲等[24]和馬進(jìn)等[22]研究發(fā)現(xiàn)高濃度(500 mmol·L-1NaCl)和長(zhǎng)時(shí)間(8 d)鹽脅迫處理顯著降低大麥(HordeumvulgareL.)和紫花苜蓿(MedicagosativaL.)GR活性的結(jié)論相似。MDAR和DHAR是AsA再生關(guān)鍵酶[45]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫處理顯著提高耐鋁型杉木家系YX26葉片MDAR和DHAR活性，而敏感型杉木家系YX5葉片MDAR略有增加，但DHAR活性卻顯著受抑。鋁脅迫下耐鋁型杉木家系YX26通過(guò)顯著增加MDAR和DHAR活性，促進(jìn)AsA的循環(huán)再生，一方面有利于維持植物細(xì)胞內(nèi)較高的還原態(tài)微環(huán)境，避免細(xì)胞內(nèi)環(huán)境呈現(xiàn)氧化態(tài)而帶來(lái)的一系列問(wèn)題。另一方面，增加AsA和GSH的積累，還能有效清除鋁脅迫誘導(dǎo)的活性氧，這也在一定程度上說(shuō)明了鋁脅迫下耐鋁型杉木YX26受到的氧化損傷程度低于鋁敏感型杉木家系YX5的原因，該結(jié)果同時(shí)也表明AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶同樣在調(diào)控杉木耐鋁性中起著重要作用。

AsA和GSH作為非酶性抗氧化物質(zhì)，同樣在清除植物體內(nèi)活性氧方面具有重要作用，它們通常與AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶相互偶聯(lián)起作用[46]。與前人研究結(jié)果類似，本研究中也發(fā)現(xiàn)鋁脅迫顯著增加了不同耐鋁型杉木家系葉片中AsA和GSH含量，這可能是杉木應(yīng)對(duì)鋁毒的一種適應(yīng)性反應(yīng)，通過(guò)促進(jìn)二者的積累來(lái)增強(qiáng)自身的耐性。盡管鋁脅迫均顯著增加了AsA和GSH的含量，但敏感型杉木家系YX5葉片中AsA含量高于耐鋁型杉木YX26，這可能與其細(xì)胞內(nèi)大量的AsA用于解毒有關(guān)。此外，鋁脅迫下耐鋁型杉木家系YX26中APX活性增幅大于YX5也從側(cè)面證實(shí)鋁脅迫下YX26中AsA維持較高的周轉(zhuǎn)速率，從而減輕過(guò)氧化氫對(duì)YX26葉片造成的氧化損傷。鋁脅迫下耐鋁型杉木家系YX26葉片中GSH含量的增幅要顯著大于敏感型杉木家系YX5，GSH含量的增加一方面有利于為AsA-GSH循環(huán)提供充足底物，維持AsA-GSH循環(huán)高效運(yùn)轉(zhuǎn)，另一方面能使植物具有更強(qiáng)的活性氧清除能力，有效減輕鋁脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。因此，這可能也是鋁脅迫下耐鋁型杉木家系YX26受到的氧化損傷要低于鋁敏感型杉木家系YX5的可能原因。

綜上所述，與鋁敏感型杉木家系YX5相比，鋁脅迫下耐鋁型杉木家系YX26通過(guò)維持較高的CAT和POD活性，同時(shí)通過(guò)增加鋁脅迫下APX、DHAR和MDAR的活性，提高AsA-GSH循環(huán)的運(yùn)行效率，促進(jìn)AsA和GSH的再生，進(jìn)而增強(qiáng)其自身對(duì)活性氧的清除能力，從而最終減輕鋁脅迫對(duì)杉木葉片造成的氧化損傷，使植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鋁能力。