梁冠盈 遲秋君 李曉梅

卵巢癌是女性三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿和侵襲性強等特點使卵巢癌成為婦科惡性腫瘤之首位[1]。卵巢癌主要以手術(shù)治療為主，配合放療和化療等，卵巢癌的復(fù)發(fā)率較高，復(fù)發(fā)后再次化療極易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療失敗，并且卵巢癌的五年生存率極低[2-4]。

伏立諾他是一種去乙酰化酶抑制劑(Histone deacetylase inhibitor，HDACI)，可以特異性的干擾去乙?；傅幕钚?，該酶能夠催化組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的酪氨酸殘基去乙?；?。伏立諾他在2006年被美國FDA批準(zhǔn)為治療加重、持續(xù)和復(fù)發(fā)或用2種全身性藥物治療后無效的外周皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。近年來隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)伏立諾他對許多腫瘤具有較好的治療效果[5-7]。然而伏立諾他對卵巢癌SKOV3的作用機制未見報道。

腫瘤細(xì)胞具有無限增殖能力，其抗腫瘤藥物治療的共同途徑就是調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過程中具有重要的作用，一類是抗凋亡蛋白Bcl-2，另一種是凋亡蛋白Bax在腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1能夠調(diào)控細(xì)胞周期，影響腫瘤細(xì)胞增殖情況，在抗腫瘤治療過程中發(fā)揮著重要作用。p53基因為抑癌基因，存在于正常細(xì)胞核中，對細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，對細(xì)胞損傷分化具有抑制作用，主要功能為檢測基因組損傷、啟動修復(fù)損傷機制、抑制或阻滯細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞凋亡等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。在腫瘤組織中組蛋白去乙酰化酶存在過表達(dá)或者異常聚集，導(dǎo)致核小體組蛋白低乙酰化，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)解聚和轉(zhuǎn)錄異常。研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化能夠改變?nèi)旧|(zhì)重構(gòu)，降低組蛋白復(fù)合體附近DNA的轉(zhuǎn)錄作用，賴氨酸殘基發(fā)生不同水平的甲基化能夠引起不同的活化狀態(tài)，在賴氨酸甲基化中組蛋白H3第4位賴氨酸乙?；?Histone-H3 lysine-4 acetylation，H3K4ac)和組蛋白H3第27位賴氨酸乙?；?Histone-H3 lysine-27 acetylation，H3K27ac)尤其重要，與基因的轉(zhuǎn)錄活化和轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，伏立諾他能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞周期阻滯，同時誘導(dǎo)變異細(xì)胞的凋亡[11]。因此，本研究以卵巢癌SKOV3為研究對象，探討伏立諾他對SKOV3細(xì)胞增殖、周期的影響和p53的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、1640培養(yǎng)液(Hyclone，美國)；TBD優(yōu)級胎牛血清(灝洋生物，天津)；CCK-8試劑盒(Dojindo，日本)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒(天根，北京)；H3K4ac antibody和H3K27ac antibody(Abcam，UK)；光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)；酶標(biāo)儀(TECAN，瑞士)；人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購自上海中橋新舟。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞長至80%～90%時，加入含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶1～2 mL，置于含5% CO2、37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中1～3 min取出，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞變圓時加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，加入新鮮培養(yǎng)基，用滴管混合均勻，分裝于不同的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，采用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。細(xì)胞實驗共分為四組，分別為空白組(Blank)、伏立諾他高劑量(VG)組(16 μmol/L)、伏立諾他中劑量(VZ)組(8 μmol/L)和伏立諾他低劑量(VD)組(4 μmol/L)。

1.3 CCK-8法檢測伏立諾他對SKOV3細(xì)胞增殖影響

取對數(shù)生長期人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為104/mL加入96孔培養(yǎng)板，每孔加入200 μL置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞鋪滿后每孔加入濃度為4 μmol/L、8 μmol/L和16 μmol/L的伏立諾他200 μL，空白組加入同體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每個濃度重復(fù)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，干預(yù)結(jié)束后每孔加入10 μL的CCK-8繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度值。

1.4 Western blot檢測SKOV3細(xì)胞H3K4ac和H3K27ac蛋白表達(dá)

將SKOV3細(xì)胞以5×105/mL密度接種在六孔板中，每孔加入2 mL的細(xì)胞懸液，置于5% CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿瓶底面積的80%以上時將相應(yīng)的孔板分為四組即空白組、伏立諾他高劑量組(16 μmol/L)、中劑量組(8 μmol/L)和低劑量(4 μmol/L)，加入相應(yīng)的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上清液每孔加入400 μL含有PMSF的Western及IP裂解液，運用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞后收集到1.5 mL離心管中，冰浴勻漿使細(xì)胞充分裂解，12 000 r/min離心20 min，取上清液分裝于離心管中，測定各組蛋白濃度，加入SDS-PAGE樣蛋白緩沖液，進(jìn)行高溫變性，取等量的蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫孵育2 h后加入稀釋后的一抗(H3K4ac，1∶1 000；H3K27ac，1∶1 000；GAPDH，1∶5 000稀釋)，在4℃的條件下孵育過夜，之后TBST室溫漂洗5次，每次10 min，漂洗結(jié)束加入辣根酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，在進(jìn)行漂洗5次，ECL顯色，得到掃描條帶，利用圖像處理軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.5 卵巢癌SKOV3細(xì)胞中mRNA表達(dá)

1.5.1 SKOV3細(xì)胞總RNA提取 取對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞平鋪于12孔培養(yǎng)板，待SKOV3細(xì)胞融合至80%時加入濃度為4 μmol/L、8 μmol/L和15 μmol/L伏立諾他，對照組加入同體積的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄上清液，PBS沖洗兩次，收集不同組別的SKOV3細(xì)胞，加入1 mL的Trizol裂解液充分裂解，裂解后置于冰浴靜置5 min，再加入預(yù)冷的0.2 mL的三氯甲烷，用力振蕩后靜置3 min，12 000 r/min，離心15 min，取上清液加入等體積預(yù)冷的異丙醇，靜置10 min，12 000 r/min，離心10 min，棄上清，加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇，洗掉沉淀中的異丙醇，10 000 r/min，離心10 min，棄上清，加入30 μL的DEPC水中，測定RNA濃度。

1.5.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取PCR專用管加入1 μL OligodT，RNA量由濃度經(jīng)計算決定，以DEPC水補足至8 μL，離心機6 000 r/min，2 min離心，置入PCR儀，70℃金屬浴10 min，取出后置于冰盒室溫進(jìn)行以下操作：即向體系依次加入下列成份：5×反轉(zhuǎn)錄酶Buffer 4 μL，dNTP(2.5 mM)4 μL，0.1 M DTT 2 μL，RNAse Inhabitor 1 μL，M-MLV 1 μL，置入PCR儀，95℃ 5 min→37℃ 1 h→4℃。

1.5.3 實時熒光定量PCR檢測 此過程為20 μL體系，用GAPDH作為內(nèi)參校正，Bcl-2上游引物：5′-CCTTTGTGTAACTGTACGGCC 3′，下游引物：5′-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTC GAC-3′；Bax上游引物：5′-GGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游引物：5′-TCCCGGAGGAAGTCCATT-3′；CyclinD1上游引物：5′-GGATGCTGGAGGTCTGCG-3′，下游引物：5′-AGAGGCCACGAACATGCAAG-3′；GAPDH上游引物：5-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3，下游引物：5-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3。按照熒光定量試劑盒的說明書，在96孔板中依次加入：Maxima SYBR Green qPCR Master 10 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，Template DNA 1 μL，DEPC水 7 μL，每個樣本均設(shè)置3個復(fù)孔，預(yù)變性，95℃ 5 min；變性，95℃，30 s；退火，60℃，30 s；延伸，72℃，30 s；重復(fù)變性、退火、延伸，共55個循環(huán)，充分延伸，72℃，10 min，結(jié)束溫度為4℃。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 伏立諾他對SKOV3細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示不同濃度的伏立諾他能夠?qū)KOV3細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用。與空白組比較，伏立諾他低、中、高劑量細(xì)胞增殖明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與低劑量伏立諾他比較，中、高劑量伏立諾他的細(xì)胞增殖明顯降低，與中劑量伏立諾他比較，高劑量伏立諾他的細(xì)胞增殖明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。伏立諾他對SKOV3細(xì)胞的作用呈劑量依賴性增強(表1)。

表1 不同濃度伏立諾他對SKOV3細(xì)胞增殖作用影響Table 1 Effects of Vorinostat on the proliferation of SKOV3 cells

2.2 伏立諾他對SKOV3細(xì)胞蛋白表達(dá)影響

Western blot檢測結(jié)果顯示不同濃度的伏立諾他能夠增加SKOV3細(xì)胞中H3K4ac和H3K27ac蛋白表達(dá)。與空白組比較，低、中、高劑量組的伏立諾他干預(yù)后SKOV3細(xì)胞H3K4ac和H3K27ac蛋白明顯增加(P<0.05)，且隨著伏立諾他劑量的增加作用增強(圖1)。

圖1 伏立諾他對SKOV3細(xì)胞H3K4ac和H3K27ac蛋白表達(dá)影響Figure 1 Effect of Vorinostat on the expression of H3K4ac and H3K27ac protein in SKOV3 cells

2.3 伏立諾他對SKOV3細(xì)胞mRNA表達(dá)影響

與空白組比較，伏立諾他低、中、高劑量組中抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯降低，凋亡蛋白Bax mRNA的表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與空白組比較，伏立諾他低、中、高劑量組中細(xì)胞周期蛋白CyclinD1 mRNA表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與空白組比較，伏立諾他低、中、高劑量組中腫瘤抑制因子p53 mRNA表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 伏立諾他對SKOV3細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響Table 2 Effect of Vorinostat on the expression of p53，Bax，Bcl-2 and Cyclin D1 mRNA in SKOV3 cells

3 討論

腫瘤細(xì)胞處于一種細(xì)胞凋亡與增殖之間失衡的狀態(tài)，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系，細(xì)胞凋亡異常，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞凋亡是一個級聯(lián)反應(yīng)，包括信號啟動、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及執(zhí)行等多因素調(diào)控的過程。當(dāng)前抗腫瘤藥物的共同途徑就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其中細(xì)胞凋亡有兩個主要途徑：外源性途徑和內(nèi)源性途徑，即死亡受體途徑和線粒體途徑。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為線粒體在細(xì)胞凋亡中處于中心地位，凋亡信號經(jīng)線粒體放大，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激活凋亡蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序[12]。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過程中具有重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族蛋白存在兩種不同的功能，一類是抗凋亡蛋白如Bcl-2和Bcl-xl，另一種則是凋亡蛋白如Bax促進(jìn)凋亡的發(fā)生[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)與空白組比較，給予不同濃度的伏立諾他能夠明顯抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)，而凋亡基因Bax mRNA表達(dá)明顯增加，表明伏立諾他能夠促進(jìn)卵巢癌SKOV3的凋亡。CyclinD1為細(xì)胞周期調(diào)控基因，對細(xì)胞周期具有調(diào)控作用。給予不同濃度的伏立諾他能夠明顯降低細(xì)胞周期蛋白CyclinD1 mRNA表達(dá)，表明伏立諾他對細(xì)胞周期具有阻滯作用。CCK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組比較，伏立諾他能夠明顯降低卵巢癌SKOV3吸光度值，表明伏立諾他能夠抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖；伏立諾他高、中、低劑量組組間比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異，表明伏立諾他對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。

目前研究證明表觀遺傳能夠調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其主要核心就是組蛋白共價修飾，組蛋白共價修飾廣泛參與基因的轉(zhuǎn)錄沉默[16]。組蛋白乙?；癄顟B(tài)由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶共同決定的[17]。組蛋白去乙酰化可以引起抑癌基因p53的表達(dá)，p53被抑制或過度激活都可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[18-19]。本研究Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；敢种苿┓⒅Z他能夠明顯增加H3K4ac和H3K27ac蛋白的表達(dá)，表明伏立諾他能夠明顯抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，進(jìn)而增加組蛋白乙?；负?。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予不同濃度的伏立諾他后p53 mRNA表達(dá)明顯增加，且隨著劑量的增加作用增強。

綜上所述，組蛋白去乙?；敢种苿┓⒅Z他能夠抑制卵巢癌SKOV3的增殖和促進(jìn)凋亡作用，其可能機制是增加H3K4ac和H3K27ac蛋白表達(dá)，激活抑癌基因p53的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。