童文羽 朱志強(qiáng) 曾 智

本試驗(yàn)改進(jìn)了農(nóng)業(yè)部783號公告-2-2006水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的高效液相色譜法，并對樣品的提取條件和色譜方法進(jìn)行了優(yōu)化分析，確定使用鹽酸酸化乙腈提取，固相萃取小柱凈化，高效液相色譜-熒光檢測器檢測、外標(biāo)法定量的分析方法。本方法漂移率小，對三種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)在0.999以上，線性范圍1～1000μg/L，定量限1μg/kg。對草魚、對蝦樣品進(jìn)行三種喹諾酮類藥物加標(biāo)回收率的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，回收率在79.2%～105.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.83%～9.85%之間，批次間標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.00%～10.57%之間，說明方法前處理提取效率和準(zhǔn)確度滿足分析要求。

1.材料與方法

1.1 儀器、試劑、標(biāo)準(zhǔn)品與耗材

試驗(yàn)材料來自歷次農(nóng)業(yè)部例行采集樣品，品種有草魚和對蝦。

島津LC-20AD高效液相色譜儀（配熒光檢測器RF-20A），LC Solution工作站與Waters e2695高效液相色譜儀（配熒光檢測器2475），Empower 3工作站；色譜柱為Thermo Acclaim C18與安捷倫ZORBAX SBC18，規(guī)格均為4.6mm×250mm，I.D.5μm。

三種沙星標(biāo)準(zhǔn)品均為Dr.Ehrenstorfer。其中諾氟沙星純度為99.1%，環(huán)丙沙星純度為95.0%，恩諾沙星純度為99.0%。分別稱取諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品各0.01g（精確至0.0001g），用色譜純級甲醇溶解，必要的時(shí)候使用超聲助融，定容到100mL棕色容量瓶中，4℃冷藏保存，有效期6個(gè)月。

試驗(yàn)使用試劑及其他儀器規(guī)格如下（表1-表3）：

1.2 實(shí)驗(yàn)前處理的優(yōu)化

1.2.1 樣品的處理方法

取魚、蝦肌肉，切成小塊，勻漿機(jī)打成勻漿后準(zhǔn)確稱取5.00g（±0.05g）樣品，置于50mL離心管中，加入15mL提取劑，蓋緊蓋子，置于振蕩器上振蕩5min，4500r/min離心5min，上清液倒入另外一支50mL離心管中。

表1 試驗(yàn)使用的各試劑品牌個(gè)規(guī)格

表4 甲酸酸化和鹽酸酸化的乙腈提取的回收率

表5 提取次數(shù)的回收率

1.2.2 提取液的選擇和優(yōu)化

根據(jù)農(nóng)業(yè)部783、1077號公告，選擇酸化乙腈作為提取劑，因?yàn)猷Z酮類都是兩性化合物，提取時(shí)在提取劑中加入酸會提高提取效率。分組使用100%乙腈、1%甲酸酸化和每2500mL提取劑加入20mL50%鹽酸進(jìn)行酸化的乙腈作為提取劑，每次提取用量15mL。

表2 固相萃取小柱品牌、規(guī)格

表3 其他儀器規(guī)格型號

從表4可以看到，由于這三種喹諾酮類藥物都是兩性化合物，酸化的提取劑可以大大提高提取回收率，而提取實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。其中鹽酸酸化的乙腈作為提取劑的回收率最高，原因是鹽酸的酸性較甲酸強(qiáng)。同時(shí)，提取3次比2次顯著提高回收率。對提取次數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)果如表5，提取4次后，諾氟沙星回收率有提高，但環(huán)丙沙星和恩諾沙星的回收率并沒有顯著提高，因此采用鹽酸酸化的乙腈作為提取劑，提取3次即可。

1.2.3 樣品的凈化方法的優(yōu)化

表6 3種固相萃取小柱以及不使用小柱的加標(biāo)回收率

表7 方法的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢測限

喹諾酮類因?yàn)槭莾尚曰衔?，所以在正己烷中的溶解度很差。因此正己烷在喹諾酮類的前處理過程中常用作去雜試劑。

旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾或氮吹干提取液后，用2.0mL磷酸二氫鉀-甲醇溶液溶解殘?jiān)?4.0g磷酸二氫鉀溶于230mL水，用25%氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，用該溶液將20mL甲醇稀釋至100mL），在提取液中加入2mL正己烷，渦旋，靜置后去掉上層的正己烷，正己烷凈化操作需要進(jìn)行2次，如果樣品基質(zhì)特別復(fù)雜，凈化次數(shù)可酌情增加。

根據(jù)唐巍、盧艷芬等人報(bào)道，水產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量測定前處理中可使用Waters Oasis HLB固相萃取小柱凈化，農(nóng)業(yè)部1025號公告則使用C18小柱，因此將包括這兩種小柱在內(nèi)的一共3種固相萃取小柱以及不使用固相萃取凈化分組做對比實(shí)驗(yàn)。

所有的萃取小柱在使用前均使用3.0mL甲醇和3.0mL水激活萃取柱，C18、HLB、MCX、PRS小柱激活后加入備用樣品過柱，6.0mL純水淋洗去雜，用6mL的6%氨化甲醇（6mL氨水用甲醇稀釋至100mL）洗脫，收集洗脫液，于45℃氮吹至干，1.0mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?jīng)濾膜過濾，供液相色譜分析使用；

不使用固相萃取小柱凈化的對照組，在第一次氮吹后直接使用1mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?定容后過濾供液相測定使用。

圖1 流動(dòng)相為乙腈：四丁基溴化銨-磷酸緩沖液體積比5∶95的標(biāo)準(zhǔn)品重疊圖

根據(jù)表6的統(tǒng)計(jì)，不使用萃取小柱回收率是很高的，缺點(diǎn)是色譜圖上的雜質(zhì)依然較多，而使用固相萃取小柱后，盡管回收率都出現(xiàn)了不同程度的降低，但從儀器圖譜上來看，使用固相萃取小柱可以顯著的減少雜質(zhì)峰，減少干擾。因此使用萃取小柱是有意義的。

1.3 色譜條件

農(nóng)業(yè)部783號公告中使用的是乙腈∶四丁基溴化銨-磷酸（pH3.1）=95∶5作為流動(dòng)相，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)以下幾個(gè)問題：

由于喹諾酮類屬于兩性分子，傳統(tǒng)的色譜柱常常會因?yàn)闅堄喙璐蓟徒饘俨患兾锏拇嬖诙鴮?dǎo)致色譜峰拖尾。在農(nóng)業(yè)部783號公告的方法中，在流動(dòng)相中加入四丁基溴化銨試劑（3.22g四丁基溴化銨溶于1000mL水中，磷酸調(diào)pH值為3.1），作為離子對試劑降低其極性，從而改善峰形和提高分離度。但喹諾酮類樣品在色譜柱保留時(shí)間對pH 值很敏感，而離子對試劑本身無法起到有效的緩沖作用，可能造成目標(biāo)物質(zhì)保留時(shí)間的漂移，如圖1。

可以看到乙腈-四丁基溴化銨流動(dòng)相雖然峰型和分離度較好，但出現(xiàn)了在保留時(shí)間有漂移。同時(shí)流動(dòng)相中的四丁基溴化銨很容易產(chǎn)生氣泡，即便長時(shí)間超聲脫氣也很難改善，因此參考農(nóng)業(yè)部1025號公告，使用乙腈-磷酸三乙胺（3.4mL濃磷酸溶于1000mL水中，三乙胺調(diào)pH值為2.4）作為流動(dòng)相。其中乙腈：磷酸-三乙胺緩沖液體積比為18∶82，流速1.0mL/min；使用熒光檢測器，激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長450nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量20μL。該色譜條件下的標(biāo)準(zhǔn)品疊加如圖2，可以看到目標(biāo)峰的漂移相比乙腈-四丁基溴化銨作為流動(dòng)相時(shí)改善了很多，而且出峰較快，節(jié)省了時(shí)間和流動(dòng)相。

圖2 流動(dòng)相為乙腈∶磷酸-三乙胺緩沖液=18∶82的標(biāo)準(zhǔn)品重疊圖

圖3 3種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（三種沙星均為5μg/L）

2.結(jié)果與討論

2.1 色譜分離

在優(yōu)化出的色譜條件下，分析得到標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白和加標(biāo)樣品的色譜圖，見圖4?？梢钥吹?，在所使用的色譜條件下，目標(biāo)峰得到了很好的分離。

2.2 檢出限和定量限

取三種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動(dòng)相稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液，在優(yōu)化出的色譜條件下進(jìn)樣，以各組分質(zhì)量濃度與色譜峰面積進(jìn)行線性回歸，繪制工作曲線，得到回歸方程如表7。

因?yàn)閷?shí)際工作中樣品的基質(zhì)較為復(fù)雜，因此，為減少雜峰干擾，故選用了10倍信噪比（S/N）計(jì)算儀器檢出限，諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星的儀器檢出限為0.20μg/L、0.30μg/L、0.45μg/L。同時(shí)，根據(jù)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)情況以及同時(shí)測定的要求，確定三種沙星的定量限為1.0μg/Kg。

表8 方法的回收率

表9 方法的精密度

2.3 回收率和精密度

分別對草魚和對蝦樣品加標(biāo)，測定加標(biāo)回收率和方法精密度。測定結(jié)果見表8-9，三種喹諾酮類在草魚和對蝦兩種樣品中的平均回收率在79.2%～105.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.83%～9.85%之間，批次間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.00%～10.57%之間。

2.4 結(jié)論

本研究采用了鹽酸酸化乙腈提取、正己烷和Oasis MCX固相萃取小柱凈化，使用乙腈-磷酸三乙胺作為流動(dòng)相，建立了水產(chǎn)品中恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星殘留量的高效液相色譜-熒光檢測測定方法。該方法較之農(nóng)業(yè)部783號、1025號公告方法有著定性、定量更加準(zhǔn)確，精密度高，重現(xiàn)性好，能滿足我國現(xiàn)行獸藥殘留檢測分析要求，可用于水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星藥物殘留量的測定。