謝樹(shù)紅，黃惠娟，許玉黎，鄭小花，楊 帆

0 引 言

卵巢癌是女性癌癥死亡的第四大原因，其中卵巢上皮性癌占卵巢惡性腫瘤的90%以上，5年生存率受分期影響波動(dòng)于27%～46%[1-3]。卵巢癌的基本治療原則為廣泛腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔以順鉑聯(lián)合紫杉醇的化療方案，但易發(fā)生化療耐藥及癌灶復(fù)發(fā)，據(jù)統(tǒng)計(jì)90%的晚期卵巢癌患者死亡原因與多藥耐藥的發(fā)展有關(guān)[4]。因此，目前對(duì)于卵巢癌的治療迫切需要尋找一種既有效且不良反應(yīng)小的新型藥，對(duì)提升卵巢癌患者的生活質(zhì)量、生存率等具有重要意義。多方研究表明，富含于天然橄欖油或橄欖葉中的橄欖苦苷在對(duì)抗子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤中已顯示出積極的抑癌作用。本研究欲通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究橄欖苦苷對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖是否同樣有影響以及不同濃度的橄欖苦苷在不同作用時(shí)間下細(xì)胞改變情況。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株、藥物及試劑實(shí)驗(yàn)用卵巢癌SKOV3細(xì)胞由福州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科提供。橄欖苦苷(Funakoshi，Tokyo Japan )，McCoys 5A培養(yǎng)基(美國(guó)sigma公司)、胎牛血清(美國(guó)gibco公司)、青霉素鏈霉素雙抗溶液(美國(guó)gibco公司)、0.25%胰蛋白酶(美國(guó)gibco公司)、PBS緩沖液(美國(guó)Hyclone公司)、cck-8試劑盒(美國(guó)genview公司)，DMSO溶液(二甲基亞砜，南京凱基生物公司)，25 cm2培養(yǎng)瓶、15 mL離心管、50 mL離心管(美國(guó)corning公司)

1.2方法①細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清、1%雙抗溶液配制的McCoys 5A完全培養(yǎng)基將SKOV3卵巢癌細(xì)胞接種到25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中。待電子顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合度時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代，平均3 d傳代1次。②細(xì)胞接種：SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合度后，用0.25%胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后重新調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/mL，以細(xì)胞數(shù)5000個(gè)/孔接種至96孔板，即每孔100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，每組6個(gè)平行樣本，設(shè)置5個(gè)細(xì)胞組，包括4個(gè)不同濃度藥物組(藥物+培養(yǎng)液+細(xì)胞)和1個(gè)對(duì)照組(培養(yǎng)液+細(xì)胞)。設(shè)1個(gè)空白組[僅含培養(yǎng)液，用于校正培養(yǎng)液對(duì)吸光度(A)的影響]，周邊空白格以PBS緩沖液等體積填充。③CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化：接種在96孔板的細(xì)胞貼壁后,每孔加入10 μL不同濃度的橄欖苦苷(800、400、200、100、0 μg/mL)，其中橄欖苦苷粉末用DMSO有機(jī)溶劑溶解，用McCoy’s 5A培養(yǎng)基稀釋到需要濃度，并確保DMSO終濃度<0.1%以避免對(duì)細(xì)胞的損害作用。分別培養(yǎng)細(xì)胞至24、48、72 h(觀察時(shí)間的選擇基于SKOV3細(xì)胞傳代時(shí)間在48～72 h)。在相應(yīng)時(shí)間后以換液形式加入含10%CCK-8的培養(yǎng)基，置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)60 min后用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定細(xì)胞A值。④根據(jù)細(xì)胞不同生長(zhǎng)時(shí)間A值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，并以柱狀圖比較不同濃度下藥物抑制率隨時(shí)間的變化。其中細(xì)胞抑制率的計(jì)算公式如下：

抑制率(%)=[1-(藥物組-空白組)/(對(duì)照組-空白組)] ×100%

2 結(jié) 果

2.1不同濃度橄欖苦苷與作用時(shí)間下SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)A值比較相同作用時(shí)間下，各藥物濃度組與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，A值隨著藥物濃度增大而變小，與對(duì)照組A值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相同作用濃度下，100、200、400 μg/mL的細(xì)胞可隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)A值增大，3個(gè)時(shí)間A值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在藥物濃度800 μg/mL時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，在24 h和48 h內(nèi)A值未發(fā)生明顯變化(P>0.05)，當(dāng)作用時(shí)間達(dá)72 h時(shí)，A值與24、48 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線逐漸降低趨向水平。見(jiàn)表1、圖1。

組別A值24h48h72h空白組0.61±0.010.58±0.020.57±0.02對(duì)照組0.89±0.021.47±0.062.02±0.03藥物組 100μg/mL藥物組0.87±0.01*1.40±0.04*#1.94±0.02*#△ 200μg/mL藥物組0.83±0.02*1.27±0.06*#1.77±0.10*#△ 400μg/mL藥物組0.78±0.02*1.03±0.07*#1.39±0.05*#△ 800μg/mL藥物組0.64±0.02*0.64±0.02*0.70±0.03*#△與對(duì)照組相比,*P<0.05;同一濃度下,與24h比較,#P<0.05;與48h比較,△P<0.05

圖1 不同濃度橄欖苦苷與作用時(shí)間下的SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2不同濃度橄欖苦苷與作用時(shí)間下SKOV3細(xì)胞抑制率比較在相同作用時(shí)間下，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨著藥物濃度增大而增大，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在相同濃度下，藥物的抑制率并未隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著差異，不同時(shí)間抑制率兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在100、200、400、800 μg/mL的濃度梯度下，細(xì)胞抑制率逐漸增大，但抑制率未隨作用延長(zhǎng)發(fā)生顯著改變。見(jiàn)表2。

組別細(xì)胞抑制率24h48h72h100μg/mL藥物組6.46±10.517.62±7.645.39±3.11200μg/mL藥物組21.34±8.97*22.02±9.01*17.24±7.48*400μg/mL藥物組41.05±5.32*#49.10±9.82*#43.20±4.71*#800μg/mL藥物組88.44±6.64*#△92.80±3.60*#△90.72±2.83*#△與100μg/mL藥物組比較,*P<0.05;與200μg/mL藥物組比較,#P<0.05;與400μg/mL藥物組比較,△P<0.05

3 討 論

橄欖苦苷是富含于天然橄欖油或橄欖葉中的一種重要的苯酚類咧環(huán)烯醚萜苷，更是廣泛存在于木犀科的木樨欖屬、丁香屬、女貞屬、木犀屬和茉莉?qū)僦参镏衃5]。目前已證明橄欖苦苷對(duì)心、腦、肝、腎、皮膚、骨骼等均具有保護(hù)作用，既不對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用又可用于降血壓、降血糖、抗腫瘤、治療阿爾茨海默癥及預(yù)防骨質(zhì)疏松癥等[5-8]。本次體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的的增殖，0～800 μg/mL時(shí)隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線逐漸降低趨向水平，在100、200、400、800 μg/mL的濃度梯度下，細(xì)胞抑制率逐漸增大，但抑制率未隨作用延長(zhǎng)發(fā)生顯著改變。當(dāng)藥物濃度達(dá)800 μg/mL時(shí)，48 h內(nèi)細(xì)胞幾乎停止增殖狀態(tài)不佳。SKOV3細(xì)胞的正常傳代周期為48～72 h，當(dāng)培養(yǎng)條件極佳時(shí)，甚至可24 h增殖至生長(zhǎng)高峰傳代。我們推測(cè)當(dāng)濃度達(dá)800 μg/mL時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境可能出現(xiàn)完全不適合SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測(cè)，橄欖苦苷對(duì)SKOV3細(xì)胞的增殖有抑制作用，抑制強(qiáng)度在0～800 μg/mL條件下呈現(xiàn)出濃度依賴性，而抑制強(qiáng)度可能無(wú)時(shí)間依賴性。對(duì)橄欖苦苷作用時(shí)間的分析有2點(diǎn)：一是該藥物可能確實(shí)不具備時(shí)間依賴性；二是藥物反應(yīng)迅速，可能在測(cè)的第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)24 h前就已逐步達(dá)到最大作用效應(yīng)。這一結(jié)果的出現(xiàn)給未來(lái)橄欖苦苷運(yùn)用臨床治療卵巢癌患者時(shí)，可能不需要考慮藥物反應(yīng)時(shí)間即可維持穩(wěn)定的作用強(qiáng)度。

對(duì)該實(shí)驗(yàn)的具體作用機(jī)制提出以下2種設(shè)想：橄欖苦苷與雌二醇(E2)具有相同的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，這種相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致橄欖苦苷可有微弱的植物雌激素作用或可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌激素受體起拮抗作用。有研究稱植物雌激素可以改變基因的表達(dá)，使抑癌基因和促癌基因的表達(dá)發(fā)生改變，從而表現(xiàn)出預(yù)防腫瘤和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[9]，如橄欖苦苷可同時(shí)通過(guò)延緩乳腺癌細(xì)胞周期S期(在細(xì)胞生長(zhǎng)分裂時(shí)延緩細(xì)胞DNA的合成)、上調(diào)細(xì)胞周期蛋依賴白性抑制劑p21、抑制抗凋亡和促增殖的NF-KB蛋白及抑制主要致癌的靶細(xì)胞周期蛋白D1共同對(duì)細(xì)胞增殖起到強(qiáng)烈的抑制作用[10]。其次研究證明橄欖苦苷通過(guò)抑制與乳腺癌腫瘤細(xì)胞失控相關(guān)的雌激素依賴的ERK1/2 快速信號(hào)的激活[11]，從而在乳腺癌細(xì)胞增殖中起到化學(xué)預(yù)防抑制作用。通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察，我們推測(cè)卵巢癌與乳腺癌同為激素依賴性腫瘤，橄欖苦苷可能通過(guò)延緩SKOV3細(xì)胞DNA的合成等以上作用途徑使細(xì)胞的生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)從而表現(xiàn)出增殖抑制效果。

橄欖苦苷水解后生成游離的羥基酪醇(hydroxytyrosol，HT)[12]，實(shí)驗(yàn)表明HT可通過(guò)調(diào)節(jié)親癌和抑癌信號(hào)通路阻滯腫瘤細(xì)胞的循環(huán)及誘發(fā)其凋亡[13-15]，包括乳腺癌MCF-7細(xì)胞[16]、HL60白血病細(xì)胞[17]、黑色素瘤細(xì)胞[18]、結(jié)腸癌細(xì)胞[17，19-20]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中HT通過(guò)縮短表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的半衰期來(lái)加速EGFR的降解，而EGFR在細(xì)胞中表達(dá)下降可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[21]。卵巢癌細(xì)胞中存在多種原癌基因和抑癌基因，并且有60%以上的卵巢上皮性癌存在EGFR的過(guò)度表達(dá)[22]。因此我們推測(cè)，橄欖苦苷對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用也可能是通過(guò)水解后生成HT，通過(guò)HT對(duì)細(xì)胞中原癌基因或抑癌基因的調(diào)節(jié)如下調(diào)EGFR從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。以上兩種機(jī)制推斷均有待于下一步實(shí)驗(yàn)研究證明。

綜上，橄欖苦苷作為抗腫瘤藥物具有廣闊的前景，特別是針對(duì)婦科惡性腫瘤術(shù)后的患者，橄欖苦苷在未來(lái)臨床的運(yùn)用不僅能抗腫瘤，還可預(yù)防因手術(shù)造成的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[23]，在婦科方向具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。