澤瀉總?cè)频目寡谆钚匝芯?/h1>
2018-09-04 00:40:32黃錦芳羅奮熔吳水生
福建中醫(yī)藥 2018年4期
林 娜，黃錦芳，張 雪，羅奮熔，許 文，吳水生
（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）
澤瀉是澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉Alisma orientale（Sam.） Juzep.的干燥塊莖［1］，具有利尿、降糖、降脂、抗結(jié)石等多重作用［2-5］?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明澤瀉的主要化學(xué)成分是三萜類化合物［6］，課題組前期開展了澤瀉總?cè)撇课坏母患兓に囇芯浚玫娇傒坪窟_(dá)到50%以上的三萜部位［7］?，F(xiàn)代藥理研究表明澤瀉提取物具有抗炎作用［8-9］，因此本研究采用體內(nèi)、外炎癥模型評價(jià)澤瀉總?cè)频目寡谆钚?，為澤瀉總?cè)瓶寡鬃饔玫默F(xiàn)代藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2細(xì)胞購于美國APCC公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性NIH小鼠50只，體質(zhì)量（25±7）g；SPF級雄性 SD 大鼠 50只，體質(zhì)量（164±39）g，均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（粵）2013-0002。
1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 澤瀉總?cè)茀⒄毡菊n題組前期研究的制備方法［7］，由我院中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究室制備。
1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 脂多糖（LPS）、吲哚美辛（美國Sigma公司）；Mouse-IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，上海西塘生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合溶液（PS）、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；二甲苯（廣州市中南化學(xué)試劑有限公司）；戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）。
1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士 Tecan公司）；HFU586超低溫冰箱、Primo R臺式冷凍離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；E200生物顯微鏡（日本Nikon公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）；BS-3000A系列電子天平（上海友聲衡器有限公司）；DHG-9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 澤瀉總?cè)企w外抗炎
2.1.1 澤瀉總?cè)频呐渲?稱取適量的澤瀉總?cè)疲?DMSO 配制成濃度分別為 25、50、100 μg／mL的藥液。
2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 BV-2細(xì)胞系用DMEM高糖培養(yǎng)基［含1%青鏈霉素混合溶液（PS）、10%胎牛血清（FBS）］于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 1 d傳代1次。
2.1.3 IL-6濃度與吸光度值線性曲線建立 精確稱取IL-6酶聯(lián)免疫試劑中的標(biāo)準(zhǔn)品（10 ng），配制出 1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6 pg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，設(shè)置調(diào)零孔。于酶標(biāo)儀450 nm處檢測OD值，建立IL-6濃度與吸光度值線性曲線：y＝0.002 3x＋0.055 7，r值為 0.990 7。
2.1.4 脂多糖（LPS）誘導(dǎo)細(xì)胞造模及澤瀉總?cè)茖L-6生成的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細(xì)胞以1×105個(gè)／mL的密度接種于96孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入100 μL不完全培養(yǎng)基。于培養(yǎng)箱中饑餓4 h后，設(shè)置分組如下：空白組，無藥物處理；模型組，加入 1 μg／mL LPS；澤瀉總?cè)频?、中、高劑量組，加入 1 μg／mL LPS 后，分別用 25、50、100 μg／mL 澤瀉總?cè)聘深A(yù)；吲哚美辛組，加入 1 μg／mL LPS 后，用 10 μg／mL 吲哚美辛干預(yù)。每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，干預(yù)24 h后檢測細(xì)胞上清液中IL-6的表達(dá)量，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測其吸光度值，代入線性曲線計(jì)算IL-6濃度。
2.2 澤瀉總?cè)企w內(nèi)抗炎
2.2.1 澤瀉總?cè)频呐渲?稱取適量的澤瀉總?cè)疲?.5%CMC-Na溶液配制成濃度分別為3.6、7.2、14.4 mg／mL 的藥液。
2.2.2 陽性藥物的配制 稱取適量的吲哚美辛，研磨成細(xì)粉狀，用0.5%CMC-Na配制成濃度為0.5、1 mg／mL的藥液，分別供小鼠耳輪廓腫脹及大鼠棉球肉芽腫脹試驗(yàn)。
2.2.3 澤瀉總?cè)茖Χ妆秸T導(dǎo)的小鼠耳輪廓腫脹的影響 NIH小鼠于SPF級動物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，即模型組（生理鹽水20 mL／kg），吲哚美辛組（吲哚美辛0.01 g／kg），澤瀉總?cè)频?、中、高劑量組（澤瀉總?cè)?0.072、0.144、0.216 g／kg）， 均分別灌胃給藥，1 d 1次，連續(xù)2 d。末次給藥0.5 h后，在小鼠右耳均勻緩慢涂抹二甲苯0.05 mL／只，左耳不涂抹為正常耳。2 h后處死小鼠，沿耳廓基線取下左右耳片，以直徑為0.9 cm的打孔機(jī)在左右耳同一部位打下圓耳片并稱重。以每只小鼠兩圓耳片質(zhì)量差值為腫脹度，計(jì)算抑制率，見公式1、公式2。
2.2.4 澤瀉總?cè)茖Υ笫竺耷蛉庋磕[脹的影響SD大鼠于SPF級動物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按0.15 mg／100g腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，去毛和局部消毒；切開胸部皮膚，以血管鉗擴(kuò)充皮下組織，從切口向兩前肢腋下分別塞入25 mg無菌棉球各1個(gè)，然后縫合皮膚。術(shù)后1 h按體重隨機(jī)分為5組，每組 10只，即模型組（生理鹽水 10 mL／kg）、吲哚美辛組（吲哚美辛0.01 g／kg）、澤瀉總?cè)频?、中、高劑量組（澤瀉總?cè)?0.036、0.072、0.144 g／kg），均分別灌胃給藥，1 d 1次，連續(xù)7 d。第8天麻醉放血處死大鼠，剝離棉球肉芽組織，于90°C烘箱中干燥1 h，稱重，計(jì)算肉芽組織干重及抑制率，見公式 3、公式 4。
抑制率／%＝［（模型組肉芽組織干重－給藥組肉芽組織干重）／模型組肉芽組織干重］×100% （4）
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 澤瀉總?cè)茖V-2細(xì)胞IL-6炎性因子分泌的影響 見表1。
表1 澤瀉總?cè)茖V-2細(xì)胞IL-6炎性因子分泌的影響
表1 澤瀉總?cè)茖V-2細(xì)胞IL-6炎性因子分泌的影響
注：與空白組比較，1） p＜0.01；與模型組比較，2） p＜0.01。
組別空白組模型組吲哚美辛組低劑量組中劑量組高劑量組LPS 藥物濃度／（μg／mL）—＋＋＋＋＋——1 0 25 50 100 IL-6 濃度 ／（pg／mL）165.0±12.4 378.2±13.91）179.4±22.52）359.0±21.7 303.2±14.12）213.9±19.52）
3.2 澤瀉總?cè)茖π∈蠖妆街露喞[脹的影響 見表2。
表2 澤瀉總?cè)茖π∈蠖妆街露[脹的影響
表2 澤瀉總?cè)茖π∈蠖妆街露[脹的影響
注：與模型組比較，1） p＜0.05。
組別模型組吲哚美辛組低劑量組中劑量組高劑量組n 耳腫脹試驗(yàn)10 10 10 10 10劑量 ／（g／kg）—0.010 0.072 0.144 0.216腫脹度／mg 29.3±8.4 13.1±8.71）26.1±10.8 20.9±11.8 13.8±8.91）抑制率／%0.0 55.3 10.9 28.7 52.9
3.3 澤瀉總?cè)茖Υ笫竺耷蛉庋磕[的影響 見表3。
表3 澤瀉總?cè)茖Υ笫竺耷蛉庋磕[脹的影響
表3 澤瀉總?cè)茖Υ笫竺耷蛉庋磕[脹的影響
注：與模型組比較，1） p＜0.05。
組別模型組吲哚美辛組低劑量組中劑量組高劑量組n 棉球肉芽腫脹試驗(yàn)劑量／10 10 10 10 10（g／kg）—0.010 0.036 0.072 0.144肉芽組織干重／mg 413.7±122.0 210.0±49.21）341.0±63.1 294.1±110.21）306.9±70.91）抑制率／%0.0 49.2 17.6 28.9 25.8
4 討 論
4.1 本研究通過建立脂多糖誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞體外炎癥模型，研究發(fā)現(xiàn)澤瀉總?cè)聘?、中劑量組可以顯著降低炎癥因子IL-6的濃度，且低、中、高劑量組作用成劑量相關(guān)性，提示澤瀉總?cè)圃隗w外能有效抑制炎癥因子，發(fā)揮抗炎作用。
4.2 在二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型中，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明澤瀉總?cè)聘邉┝拷M小鼠的耳廓腫脹度，與模型組比較有顯著性差異（p＜0.05），能有效抑制二甲苯引起的局部組織血管擴(kuò)張，提示了澤瀉總?cè)瓶梢詼p少炎癥介質(zhì)的釋放，抑制急性炎癥；在棉球致大鼠肉芽腫脹模型中，澤瀉總?cè)浦?、高劑量組可以顯著減輕大鼠棉球肉芽腫脹程度，提示澤瀉總?cè)茖ρ装Y造成的組織增生有抑制作用。結(jié)合體內(nèi)、外抗炎實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明澤瀉總?cè)凭哂休^好的抗炎活性。
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（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）
澤瀉是澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉Alisma orientale（Sam.） Juzep.的干燥塊莖［1］，具有利尿、降糖、降脂、抗結(jié)石等多重作用［2-5］?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明澤瀉的主要化學(xué)成分是三萜類化合物［6］，課題組前期開展了澤瀉總?cè)撇课坏母患兓に囇芯浚玫娇傒坪窟_(dá)到50%以上的三萜部位［7］?，F(xiàn)代藥理研究表明澤瀉提取物具有抗炎作用［8-9］，因此本研究采用體內(nèi)、外炎癥模型評價(jià)澤瀉總?cè)频目寡谆钚?，為澤瀉總?cè)瓶寡鬃饔玫默F(xiàn)代藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2細(xì)胞購于美國APCC公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性NIH小鼠50只，體質(zhì)量（25±7）g；SPF級雄性 SD 大鼠 50只，體質(zhì)量（164±39）g，均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（粵）2013-0002。
1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 澤瀉總?cè)茀⒄毡菊n題組前期研究的制備方法［7］，由我院中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究室制備。
1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 脂多糖（LPS）、吲哚美辛（美國Sigma公司）；Mouse-IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，上海西塘生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合溶液（PS）、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；二甲苯（廣州市中南化學(xué)試劑有限公司）；戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）。
1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士 Tecan公司）；HFU586超低溫冰箱、Primo R臺式冷凍離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；E200生物顯微鏡（日本Nikon公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）；BS-3000A系列電子天平（上海友聲衡器有限公司）；DHG-9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 澤瀉總?cè)企w外抗炎
2.1.1 澤瀉總?cè)频呐渲?稱取適量的澤瀉總?cè)疲?DMSO 配制成濃度分別為 25、50、100 μg／mL的藥液。
2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 BV-2細(xì)胞系用DMEM高糖培養(yǎng)基［含1%青鏈霉素混合溶液（PS）、10%胎牛血清（FBS）］于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 1 d傳代1次。
2.1.3 IL-6濃度與吸光度值線性曲線建立 精確稱取IL-6酶聯(lián)免疫試劑中的標(biāo)準(zhǔn)品（10 ng），配制出 1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6 pg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，設(shè)置調(diào)零孔。于酶標(biāo)儀450 nm處檢測OD值，建立IL-6濃度與吸光度值線性曲線：y＝0.002 3x＋0.055 7，r值為 0.990 7。
2.1.4 脂多糖（LPS）誘導(dǎo)細(xì)胞造模及澤瀉總?cè)茖L-6生成的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細(xì)胞以1×105個(gè)／mL的密度接種于96孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入100 μL不完全培養(yǎng)基。于培養(yǎng)箱中饑餓4 h后，設(shè)置分組如下：空白組，無藥物處理；模型組，加入 1 μg／mL LPS；澤瀉總?cè)频?、中、高劑量組，加入 1 μg／mL LPS 后，分別用 25、50、100 μg／mL 澤瀉總?cè)聘深A(yù)；吲哚美辛組，加入 1 μg／mL LPS 后，用 10 μg／mL 吲哚美辛干預(yù)。每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，干預(yù)24 h后檢測細(xì)胞上清液中IL-6的表達(dá)量，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測其吸光度值，代入線性曲線計(jì)算IL-6濃度。
2.2 澤瀉總?cè)企w內(nèi)抗炎
2.2.1 澤瀉總?cè)频呐渲?稱取適量的澤瀉總?cè)疲?.5%CMC-Na溶液配制成濃度分別為3.6、7.2、14.4 mg／mL 的藥液。
2.2.2 陽性藥物的配制 稱取適量的吲哚美辛，研磨成細(xì)粉狀，用0.5%CMC-Na配制成濃度為0.5、1 mg／mL的藥液，分別供小鼠耳輪廓腫脹及大鼠棉球肉芽腫脹試驗(yàn)。
2.2.3 澤瀉總?cè)茖Χ妆秸T導(dǎo)的小鼠耳輪廓腫脹的影響 NIH小鼠于SPF級動物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，即模型組（生理鹽水20 mL／kg），吲哚美辛組（吲哚美辛0.01 g／kg），澤瀉總?cè)频?、中、高劑量組（澤瀉總?cè)?0.072、0.144、0.216 g／kg）， 均分別灌胃給藥，1 d 1次，連續(xù)2 d。末次給藥0.5 h后，在小鼠右耳均勻緩慢涂抹二甲苯0.05 mL／只，左耳不涂抹為正常耳。2 h后處死小鼠，沿耳廓基線取下左右耳片，以直徑為0.9 cm的打孔機(jī)在左右耳同一部位打下圓耳片并稱重。以每只小鼠兩圓耳片質(zhì)量差值為腫脹度，計(jì)算抑制率，見公式1、公式2。
2.2.4 澤瀉總?cè)茖Υ笫竺耷蛉庋磕[脹的影響SD大鼠于SPF級動物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按0.15 mg／100g腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，去毛和局部消毒；切開胸部皮膚，以血管鉗擴(kuò)充皮下組織，從切口向兩前肢腋下分別塞入25 mg無菌棉球各1個(gè)，然后縫合皮膚。術(shù)后1 h按體重隨機(jī)分為5組，每組 10只，即模型組（生理鹽水 10 mL／kg）、吲哚美辛組（吲哚美辛0.01 g／kg）、澤瀉總?cè)频?、中、高劑量組（澤瀉總?cè)?0.036、0.072、0.144 g／kg），均分別灌胃給藥，1 d 1次，連續(xù)7 d。第8天麻醉放血處死大鼠，剝離棉球肉芽組織，于90°C烘箱中干燥1 h，稱重，計(jì)算肉芽組織干重及抑制率，見公式 3、公式 4。
抑制率／%＝［（模型組肉芽組織干重－給藥組肉芽組織干重）／模型組肉芽組織干重］×100% （4）
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 澤瀉總?cè)茖V-2細(xì)胞IL-6炎性因子分泌的影響 見表1。
表1 澤瀉總?cè)茖V-2細(xì)胞IL-6炎性因子分泌的影響
表1 澤瀉總?cè)茖V-2細(xì)胞IL-6炎性因子分泌的影響
注：與空白組比較，1） p＜0.01；與模型組比較，2） p＜0.01。
組別空白組模型組吲哚美辛組低劑量組中劑量組高劑量組LPS 藥物濃度／（μg／mL）—＋＋＋＋＋——1 0 25 50 100 IL-6 濃度 ／（pg／mL）165.0±12.4 378.2±13.91）179.4±22.52）359.0±21.7 303.2±14.12）213.9±19.52）
3.2 澤瀉總?cè)茖π∈蠖妆街露喞[脹的影響 見表2。
表2 澤瀉總?cè)茖π∈蠖妆街露[脹的影響
表2 澤瀉總?cè)茖π∈蠖妆街露[脹的影響
注：與模型組比較，1） p＜0.05。
組別模型組吲哚美辛組低劑量組中劑量組高劑量組n 耳腫脹試驗(yàn)10 10 10 10 10劑量 ／（g／kg）—0.010 0.072 0.144 0.216腫脹度／mg 29.3±8.4 13.1±8.71）26.1±10.8 20.9±11.8 13.8±8.91）抑制率／%0.0 55.3 10.9 28.7 52.9
3.3 澤瀉總?cè)茖Υ笫竺耷蛉庋磕[的影響 見表3。
表3 澤瀉總?cè)茖Υ笫竺耷蛉庋磕[脹的影響
表3 澤瀉總?cè)茖Υ笫竺耷蛉庋磕[脹的影響
注：與模型組比較，1） p＜0.05。
組別模型組吲哚美辛組低劑量組中劑量組高劑量組n 棉球肉芽腫脹試驗(yàn)劑量／10 10 10 10 10（g／kg）—0.010 0.036 0.072 0.144肉芽組織干重／mg 413.7±122.0 210.0±49.21）341.0±63.1 294.1±110.21）306.9±70.91）抑制率／%0.0 49.2 17.6 28.9 25.8
4 討 論
4.1 本研究通過建立脂多糖誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞體外炎癥模型，研究發(fā)現(xiàn)澤瀉總?cè)聘?、中劑量組可以顯著降低炎癥因子IL-6的濃度，且低、中、高劑量組作用成劑量相關(guān)性，提示澤瀉總?cè)圃隗w外能有效抑制炎癥因子，發(fā)揮抗炎作用。
4.2 在二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型中，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明澤瀉總?cè)聘邉┝拷M小鼠的耳廓腫脹度，與模型組比較有顯著性差異（p＜0.05），能有效抑制二甲苯引起的局部組織血管擴(kuò)張，提示了澤瀉總?cè)瓶梢詼p少炎癥介質(zhì)的釋放，抑制急性炎癥；在棉球致大鼠肉芽腫脹模型中，澤瀉總?cè)浦?、高劑量組可以顯著減輕大鼠棉球肉芽腫脹程度，提示澤瀉總?cè)茖ρ装Y造成的組織增生有抑制作用。結(jié)合體內(nèi)、外抗炎實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明澤瀉總?cè)凭哂休^好的抗炎活性。
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