楊 弘 ，靳祎祎 ，林露敏 ，林 珊 ，3，魏麗慧 ，3，林久茂 ，3

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

肝癌作為世界上的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重危害了人類健康［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在惡性腫瘤中，我國(guó)肝癌患者每年的病死率居第二位［2］。臨床上，肝癌的主要治療方法是手術(shù)以及放化療，但是在接受了手術(shù)治療后，還有50%以上的患者會(huì)發(fā)生腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，同時(shí)，雖然化療對(duì)腫瘤的發(fā)展能夠有效的控制，但化療明顯降低了患者的生存質(zhì)量及其產(chǎn)生的如胃腸道不適、骨髓抑制、脫發(fā)等毒副作用不可小覷［3］。因此，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療肝癌的局限性使得開(kāi)發(fā)療效確切、毒副作用小的抗腫瘤藥物成為了當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞觀察復(fù)方白花蛇舌草（hedyotis diffusa willd formula，HDWF）對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，為其臨床治療腫瘤提供理論根據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥物與細(xì)胞株 復(fù)方白花蛇舌草生藥材購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院；肝癌細(xì)胞株（Bel-7402、SK-Hep-1）購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 試劑與材料 DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（trypsin）、二甲亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）干粉（北京索萊寶科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，美國(guó)Hyclone公司）；Annexin V／PI染色試劑盒（南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）；CO2培養(yǎng)箱、－80℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)Leica儀器有限公司）；形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)LAS V4.1 Countes?全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó) Life公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 復(fù)方白花蛇舌草乙醇提取物的制備 取HDWF（白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽各125 g）加入70%乙醇5 kg，浸泡30 min，加熱回流提取 1 h，濾過(guò)；藥渣加入70%乙醇5 kg，再加熱回流提取1 h，濾過(guò)；合并濾液，減壓（-0.09 MPa、50 ℃）濃縮至稠膏 15 g，減壓（-0.09 MPa、50 ℃）干燥，粉碎，得干粉約90 g。先用PBS配成200 mg／mL，放入-20℃ 貯存?zhèn)溆茫怀?0 min助融，用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾，再用培養(yǎng)基配成所需要的濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將肝癌細(xì)胞株 Bel-7402、SKHep-1分別置于含 10%滅活 FBS、100 U／mL青霉素和100 μg／mL鏈霉素的DMEM和RPMI 1 640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)匯合度至80%～90%時(shí)，加入1 mL的胰蛋白酶（含0.25%EDTA）消化后，加入2 mL完全培養(yǎng)基中和以終止消化，1 000轉(zhuǎn)／min離心 3 min，棄上清，收集沉淀細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸制成新細(xì)胞懸液后傳代。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bel-7402和SK-Hep-1肝癌細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×105個(gè)／mL，每孔 100 μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，棄掉原培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度 HDWF（終濃度分別為 0.0、0.5、1.0、1.5 mg／mL）的培養(yǎng)基，每孔 100 μL，分別干預(yù) 24 h和 48 h后吸棄各孔溶液，每孔加入 0.5 mg／mL的MTT溶液100 μL，37℃孵育4 h后吸棄各孔中的液體，加入DMSO 100 μL／孔，室溫靜置 10 min，充分振蕩混勻，使結(jié)晶柴充分溶解并混勻。采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組吸光度值（A值），并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率／%＝（1－實(shí)驗(yàn)組A值／對(duì)照組A值）×100%。

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察與計(jì)數(shù) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bel-7402和SK-Hep-1肝癌細(xì)胞按2.5×105個(gè)／孔的密度接種于6孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%時(shí)，用不同濃度HDWF（0.0、0.5、1.0、1.5 mg／mL）干預(yù) 24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。拍照后細(xì)胞予消化、中和、離心、重懸處理，臺(tái)盼藍(lán)染色，于Countes?全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)兩株細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

2.5 細(xì)胞集落形成能力分析 Bel-7402和SKHep-1肝癌細(xì)胞以2.5×105個(gè)／孔接種于6孔板，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，加入不同濃度 HDWF（0.0、0.5、1.0、1.5 mg／mL）干預(yù) 24 h。 吸棄培養(yǎng)液，用 1 mL PBS清洗，經(jīng)過(guò)消化、中和、離心、重懸操作，將細(xì)胞按500個(gè)細(xì)胞／孔接種于12孔板中，2～3 d換液，且換液前于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，連續(xù)培養(yǎng)7～10 d后，當(dāng)培養(yǎng)板孔中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)，停止培養(yǎng)。吸棄上清，用PBS清洗2～3次，加入4%多聚甲醛固定15 min，用PBS清洗3遍，最后加入結(jié)晶紫染色液染色20 min后用超純水清洗4～5遍，相機(jī)拍照觀察細(xì)胞集落形成情況。

2.6 Annexin-V／PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Bel-7402和SK-Hep-1肝癌細(xì)胞以2.5×105個(gè)／孔接種于6孔板，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，加入不同濃度HDWF（0.0、0.5、1.0、1.5 mg／mL）干預(yù) 24 h 后，收集細(xì)胞；然后加入 Annexin V／FITC 和 PI各 5 μL，避光染色 15 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡及總凋亡情況。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 HDWF對(duì)Bel-7402、SK-Hep-1肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著HDWF濃度的升高，Bel-7402和SK-Hep-1肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯被抑制，具有明顯的劑量依賴和時(shí)間依賴作用，與對(duì)照組（0 mg／mL）比較差異均有非常顯著性（p＜0.01）。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：肝癌細(xì)胞Bel-7402和SK-Hep-1經(jīng)HDWF干預(yù)24 h后，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，與對(duì)照組比較具有非常顯著性（p＜0.01）。見(jiàn)表 1、表 2。

表 1 HDWF 對(duì) Bel-7402、SK-Hep-1 抑制率比較%

表 1 HDWF 對(duì) Bel-7402、SK-Hep-1 抑制率比較%

注：與對(duì)照組比較，1） p＜0.01。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組n 8 8濃度 ／（mg／mL）0.0 0.5 1.0 1.5 Bel-7402抑制率 SK-Hep-1抑制率24 h 0.00±1.16 19.19±6.101）28.40±3.391）60.14±2.081）48 h 0.00±3.21 12.38±4.621）46.08±5.801）82.26±2.511）24 h 0.00±3.07 4.60±2.901）62.20±3.311）74.10±1.051）48 h 0.00±2.67 11.50±3.211）76.50±2.301）81.00±1.161）

表 2 HDWF 對(duì) Bel-7402、SK-Hep-1細(xì)胞數(shù)的影響×106個(gè)

表 2 HDWF 對(duì) Bel-7402、SK-Hep-1細(xì)胞數(shù)的影響×106個(gè)

注：與對(duì)照組比較，1） p＜0.01。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組n 3 3濃度 ／（mg／mL）0.0 0.5 1.0 1.5 Bel-7402 1.36±0.39 1.19±0.451）0.75±0.321）0.59±0.141）SK-Hep-1 1.12±0.36 0.96±0.431）0.73±0.111）0.42±0.241）

3.2 HDWF對(duì)Bel-7402、SK-Hep-1肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示：肝癌細(xì)胞Bel-7402和SK-Hep-1經(jīng)不同濃度的HDWF干預(yù)24 h后，隨著藥物濃度的增加，Bel-7402和SK-Hep-1細(xì)胞密度逐漸減少，懸浮細(xì)胞增多，部分細(xì)胞皺縮變圓。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HDWF對(duì)Bel-7402和SKHep-1細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，并呈明顯的劑量效應(yīng)，見(jiàn)圖1。

3.3 HDWF對(duì)Bel-7402、SK-Hep-1肝癌細(xì)胞集落形成能力的影響 集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HDWF對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402和SK-Hep-1的集落形成能力有明顯的抑制作用，具有一定的劑量依賴性。該結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了HDWF具有顯著抑制肝癌細(xì)胞Bel-7402和SK-Hep-1生長(zhǎng)的作用，見(jiàn)圖2。

3.4 HDWF對(duì)Bel-7402、SK-Hep-1肝癌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，HDWF各劑量組的早期凋亡率均有明顯增加（p＜0.01），而 HDWF各劑量組的晚期凋亡率及總凋亡率均高于空白組（p＜0.05）。Annexin-V／PI染色結(jié)果顯示HDWF具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Bel-7402和SK-Hep-1凋亡的作用，凋亡細(xì)胞數(shù)隨著HDWF濃度增加而逐漸增多，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴作用，見(jiàn)表3、表4。

圖1 HDWF干預(yù)Bel-7402、SK-Hep-1細(xì)胞24 h形態(tài)圖（×200）

圖2 HDWF干預(yù)Bel-7402、SK-Hep-1細(xì)胞集落形成染色圖的影響

表3 HDWF對(duì)Bel-7402細(xì)胞凋亡率的影響%

表3 HDWF對(duì)Bel-7402細(xì)胞凋亡率的影響%

注：與對(duì)照組比較，1） p＜0.01，2） p＜0.05。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組n 3 3濃度／（mg／mL）0.0 0.5 1.0 1.5早期凋亡率4.55±0.32 10.16±0.481）23.42±2.111）25.14±2.321）晚期凋亡率0.40±0.19 0.55±0.212）0.81±0.312）2.77±0.901）總凋亡率4.95±0.50 10.61±0.901）24.22±2.321）27.91±2.831）

表4 HDWF對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞凋亡的影響（%

表4 HDWF對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞凋亡的影響（%

注：與對(duì)照組比較，1） p＜0.01。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組n 3 3濃度／（mg／mL）0.0 0.5 1.0 1.5早期凋亡率0.87±0.19 2.52±0.211）12.24±1.231）11.84±1.041）晚期凋亡率0.35±0.21 2.42±0.271）14.48±2.311）32.36±3.741）總凋亡率1.22±0.25 4.94±0.51）26.72±2.241）44.22±3.801）

4 討 論

近年來(lái)，隨著環(huán)境、生活方式、飲食習(xí)慣等改變，每年我國(guó)的肝癌發(fā)病率不斷增長(zhǎng)。臨床上常規(guī)的手術(shù)和放、化療都有其局限性，且治療后易復(fù)發(fā)，對(duì)機(jī)體的繼發(fā)性損傷也很大［4］。目前研究發(fā)現(xiàn)：臨床上中醫(yī)治療肝癌有一定的優(yōu)勢(shì)，日益受到廣泛關(guān)注，已成為醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)［5］。肝癌在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“癥瘕、臌脹、痃癖”等病范疇，認(rèn)為是由于陰陽(yáng)失調(diào)、七情郁結(jié)、臟腑受損等因素導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，氣血津液運(yùn)行失常，從而產(chǎn)生氣滯、痰凝、濕濁、熱毒蘊(yùn)結(jié)于臟腑，相互搏結(jié)，日久積漸而成的惡性疾病［6］，應(yīng)治以清熱解毒、扶正祛邪等法［7］。HDWF 具有清熱解毒、益氣健脾消食等功效，方中白花蛇舌草味苦甘，性溫，無(wú)毒，歸胃、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、消癰散結(jié)、活血止痛的功效；半枝蓮性味辛、苦、寒，歸肺、肝、腎、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛等功能；兩者以藥對(duì)方式治療腫瘤，可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫、降低端粒酶等方式達(dá)到抗腫瘤目的［8］。炙黃芪健脾補(bǔ)中、升陽(yáng)舉陷、益衛(wèi)固表；炒麥芽行氣消積、調(diào)節(jié)脾胃氣機(jī)升降失調(diào)；兩藥同用，具有補(bǔ)氣健脾、托毒生肌之功效［9］。

有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)：肝癌之所以難以控制，肝癌細(xì)胞的無(wú)限增殖是其中的主要原因之一［10］，所以，抑制肝癌細(xì)胞的增殖是抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的主要途徑之一。本研究MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：HDWF對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈一定的時(shí)間和濃度依賴性；同時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察也直接、直觀地驗(yàn)證了這一結(jié)論。肝癌細(xì)胞的集落形成實(shí)驗(yàn)顯示：HDWF能抑制肝癌細(xì)胞集落形成的能力，則進(jìn)一步驗(yàn)證了HDWF抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力。此外，肝癌細(xì)胞數(shù)的增加也與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，凋亡的過(guò)程是多基因、多途徑參與的復(fù)雜過(guò)程，某些體內(nèi)外因素能夠?qū)е录?xì)胞中的癌基因以及原癌基因被激活并過(guò)度表達(dá)，這一過(guò)程能夠直接促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且阻斷肝癌細(xì)胞凋亡，從而使肝癌細(xì)胞大量增加［11］，因此，抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的另一關(guān)鍵是誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的Annexin-V／PI結(jié)果顯示：HDWF能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，且呈劑量依賴性。

綜上所述，HDWF具有抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。但肝癌等惡性腫瘤是一種系統(tǒng)性疾病，受到增殖、凋亡相關(guān)因子的調(diào)控，并與多條相關(guān)信號(hào)通路的異常活化密切相關(guān)，因此HDWF治療肝癌等消化道腫瘤的分子作用機(jī)制及其作用靶點(diǎn)研究尚待進(jìn)一步探討。