王 宮，魏文增，吳華嵩

（福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種無(wú)過(guò)量飲酒史，以肝小葉病變?yōu)橹黧w，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積，與環(huán)境、遺傳、代謝應(yīng)激等相關(guān)的臨床病理改變綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化等肝損傷性變化。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，NAFLD成人患病率已達(dá)20%［1］，嚴(yán)重威脅人類健康。目前認(rèn)為其發(fā)病與脂質(zhì)過(guò)氧化、氧化應(yīng)激過(guò)高、脂質(zhì)代謝異常及胰島素抵抗等因素有關(guān)［2-3］。 牛樟芝（antrodia camphorata）是臺(tái)灣珍貴而特有的藥用真菌，被譽(yù)為“森林中的紅寶石”，具有降血脂、解毒保肝、強(qiáng)化免疫、抗癌等［4］作用。為探討牛樟芝滴丸對(duì)NAFLD的保護(hù)作用，本課題組開展了初步的研究，現(xiàn)總結(jié)如下：

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD雄性大鼠 48只，體重（200±20）g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室。

1.2 主要藥物與試劑 牛樟芝滴丸為實(shí)驗(yàn)室自制（總?cè)坪?.09%）；膽固醇（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170120）；陽(yáng)性對(duì)照藥水飛薊素（美國(guó) Sigma 公司，貨號(hào)：S0292，CAS 號(hào)：62666-07-1）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、游離脂肪酸（FFA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測(cè)定試劑盒（北京福瑞生物工程公司）。

1.3 模型制備與給藥方法 SD雄性大鼠飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，每組8只：空白對(duì)照組予以普通飼料；模型組，牛樟芝滴丸高、中、低劑量組（320、160、80 mg·kg-1），水飛薊素組（20 mg·kg-1）每天上午給予脂肪乳劑 10 mg·kg-1（參照文獻(xiàn)［6］并加以改進(jìn)）灌胃并給予足量的18%蔗糖溶液。3周后，每天下午予以相應(yīng)的藥物，空白對(duì)照組和模型組給予等量的CMC-Na灌胃。每周稱體重2次，調(diào)整灌胃量，至第9周末。

1.4 標(biāo)本采集與保存 給藥結(jié)束后，所有大鼠禁食24 h后，稱取體重，麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心，取血清，凍存；迅速取出肝臟，生理鹽水漂洗，濾紙吸干，稱重；隨后取肝右葉制備肝勻漿和左葉石蠟切片；進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定和光鏡檢查。

1.5 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

1.5.1 肝指數(shù) 肝指數(shù)＝肝濕重／體重×100%。

1.5.2 血清生化指標(biāo)測(cè)定 血清 ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C和FFA的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5.3 肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 取各組大鼠肝組織約1 g，生理鹽水漂洗，去除血液，剪碎，加生理鹽水，于冰浴中制成肝勻漿，離心沉淀后，取上清檢測(cè) SOD、MDA、GSH、GXH-Px，按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5.4 肝臟病理學(xué)檢測(cè) 取各組大鼠肝組織用福爾馬林固定液固定，HE染色，病理切片，觀察脂肪的病變程度并拍照。脂肪肝病理診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］：低倍鏡下，肝細(xì)胞脂肪變性占肝小葉1／3～1／2者為輕度脂肪肝；占肝小葉 1／2～3／4者為中度脂肪肝；占肝小葉 3／4以上，或者肝細(xì)胞彌漫脂肪性變性呈漁網(wǎng)狀者為重度脂肪肝。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布的以（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，2組比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟指數(shù)比較 見表1。

2.2 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較 見表2。

2.3 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表3。

表1 各組大鼠體重、肝臟指數(shù)比較

表1 各組大鼠體重、肝臟指數(shù)比較

注：與空白對(duì)照組比較，1）p＜0.01；與模型組比較，2） p＜0.05，3） p＜0.01。

組別空白對(duì)照組模型組肝指數(shù)／%2.4±0.3 2.9±0.11）2.8±0.2 2.7±0.22）2.6±0.23）2.6±0.13）n8 8 88 8 8劑量 ／（mg·kg-1）—— 8 0牛樟芝滴丸組水飛薊素組160 320 20體重／g 448.6±19.5 429.4±23.2 448.6±10.2 441.3±9.8 440.8±15.4 444.2±17.6

表2 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

表2 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

注：與空白對(duì)照組比較，1） p＜0.01；與模型組比較，2） p＜0.05，3） p＜0.01。

組別空白對(duì)照組模型組劑量／（mg·kg-1）—— 8 0牛樟芝滴丸組水飛薊素組n 8 8 88 8 8 160 320 20 ALT／（U·L-1）13.6±0.7 28.5±8.21）21.3±1.22）18.9±1.82）16.4±0.93）14.1±1.13）AST ／（U·L-1）96.3±10.1 148.1±14.21）137.8±10.6 127.7±20.22）119.6±13.23）102.6±11.13）TC／（μmol·L-1）892.2±46.5 2211.0±93.11）1546.4±49.13）1264.6±44.03）982.7±90.53）1003.4±75.03）TG ／（μmol·L-1）335.3±46.3 1355.9±103.91）867.1±38.42）628.9±18.13）476.4±29.43）364.7±40.63）FFA／（μmol·L-1）453.6±63.1 1450.5±210.61）1060.6±37.92）920.1±80.13）618.2±78.53）562.4±128.93）LDL-C／（μmol·L-1）59.6±31.1 362.6±95.81）142.5±64.83）124.3±62.23）108.8±51.83）142.5±46.63）HDL-C／（μmol·L-1）1300.0±65.3 472.7±93.31）678.0±49.82）873.9±46.73）1076.1±74.63）1138.3±102.63）

表3 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

表3 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

注：與空白對(duì)照組比較，1） p＜0.05，2） p＜0.01；與模型組比較，3） p＜0.05，4） p＜0.01。

組別空白對(duì)照組模型組牛樟芝滴丸組水飛薊素組n8 8 88 8 8劑量 ／（mg·kg-1）—— 8 0 160 320 20 SOD ／（U·mg prot-1）40.6±1.5 30.8±4.52）33.5±1.9 35.2±1.13）37.7±1.14）39.0±1.44）MDA ／（nmol·mg prot-1）2.5±0.2 6.5±2.72）4.4±0.3 3.5±0.23）2.8±0.24）2.5±0.14）GSH-Px／（U·mg prot-1）335.3±78.1 220.2±31.42）260.8±31.63）289.1±41.53）348.6±52.44）356.6±34.34）GSH ／（μmol·g prot-1）5.6±0.5 2.4±1.11）3.5±0.83）4.2±0.84）4.3±0.94）4.5±1.14）

2.4 肝臟組織病理學(xué)檢查

2.4.1 肉眼觀察 空白對(duì)照組肝無(wú)異常變化；模型組大鼠肝體積明顯增大，包膜緊張，部分肝臟顏色發(fā)生變化，呈奶黃色，切面油膩，可見脂肪成分；而水飛薊素組與牛樟芝滴丸各組肝體積、結(jié)構(gòu)均有不同程度好轉(zhuǎn)。

2.4.2 HE染色光鏡觀察 如圖1所示，空白對(duì)照組：表面光滑，肝小葉清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞索排列整齊，內(nèi)無(wú)脂肪變性、炎癥和壞死。模型組：肝細(xì)胞受損嚴(yán)重，現(xiàn)重度水變性和脂肪變性，匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)及部分肝細(xì)胞壞死。牛樟芝滴丸低、中劑量組：肝臟的受損程度、水變性和脂肪變性均比模型組減輕，可見脂肪滴空泡。牛樟芝滴丸高劑量組：肝臟的受損程度比模型組明顯減輕，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴顯著減少，形態(tài)接近空白對(duì)照組，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，僅見少許點(diǎn)狀壞死和脂肪滴空泡。水飛薊素組：肝小葉和肝索較清晰，細(xì)胞內(nèi)偶見小泡性脂肪滴空泡，無(wú)明顯水變性和脂肪變性。

3 討 論

理想的NAFLD動(dòng)物模型應(yīng)死亡率低、成模率高、重復(fù)性好、成本低，且NAFLD疾病的發(fā)生發(fā)展與人類相似，方可在實(shí)驗(yàn)中推廣研究。本文經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，可成功復(fù)制NAFLD大鼠模型，且下面各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照組比較具有非常顯著性差異（p＜0.01）：肝細(xì)胞受損且脂肪病變，體重、肝指數(shù)、血清生化指標(biāo)和肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)等發(fā)生相應(yīng)的明顯變化，提示復(fù)制大鼠NAFLD模型成功。

圖1 光鏡下各組大鼠肝臟組織病理學(xué)改變（HE染色，×200）

由于NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前普遍認(rèn)可的是 Day 等［8］提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)。 “初次打擊”主要是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）所致的脂肪變性；“第二次打擊”是氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致肝臟一系列病變。正常情況下機(jī)體產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）處于氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡。病理?xiàng)l件下，由于平衡失調(diào)，能攻擊生物膜，生成脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)物，如MDA等，此外還可抑制抗氧化系統(tǒng)，如SOD等的保護(hù)作用，產(chǎn)生較強(qiáng)的氧化應(yīng)激效應(yīng)。MDA是自由基的一種，其含量能反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平，對(duì)細(xì)胞及其成分產(chǎn)生毒性效應(yīng)［8－9］，能夠間接地反應(yīng)出細(xì)胞受損的程度。SOD為抗氧化酶系統(tǒng)，能清除ROS，降低或阻止生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷［10－11］。GSH 是 ROS 清除酶的還原性底物，能保護(hù)組織、細(xì)胞及時(shí)清除自由基對(duì)其氧化損傷，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)以GSH為主的抗氧化系統(tǒng)未及時(shí)清除ROS時(shí)，會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，形成MDA，可引起蛋白及核酸損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷死亡［12］。GSHPx是細(xì)胞內(nèi)清除ROS最重要的內(nèi)源性物質(zhì)，可特異性激活GSH，清除H2O2，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整，若體內(nèi)自由基過(guò)多可使 GSH-Px 耗竭［10，13］。HDL指高密度脂蛋白分子所攜的膽固醇，為逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)源性膽固醇酯，被稱為“血管內(nèi)的清道夫”，能將沉積在血管壁的膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼懦鲶w外。ALT、AST主要存在于肝的胞漿和線粒體中，正常血清 ALT、AST含量少，當(dāng)肝細(xì)胞受損、通透性增加以及線粒體損傷，血清中ALT、AST升高，是肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)。FFA在IR條件下大量增多，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，產(chǎn)生大量的 ROS［14］。

本研究結(jié)果顯示：牛樟芝滴丸對(duì)NAFLD有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)清除自由基、增強(qiáng)肝臟抗氧化能力、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞浸潤(rùn)、抑制炎性因子分泌，起到抗NAFLD的作用。由于牛樟芝的成分復(fù)雜，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。