李志剛 林文弢

1百色學(xué)院（廣西百色 533000）

2廣州體育學(xué)院（廣東廣州 510500）

能量攝入過(guò)多和運(yùn)動(dòng)不足導(dǎo)致的肥胖在全球范圍內(nèi)呈高發(fā)態(tài)勢(shì)，肥胖可引起胰島素抵抗（insulin re?sistance，IR），而IR是代謝綜合征的核心特征和共同危險(xiǎn)因素[1]。然而，有關(guān)肥胖引起的IR的機(jī)制尚不明晰。IR的免疫學(xué)機(jī)制研究提示，Cd11c+巨噬細(xì)胞誘發(fā)的慢性炎癥可直接導(dǎo)致IR，來(lái)自肥胖小鼠Cd11c+巨噬細(xì)胞含大量的半乳糖凝集素3（Galectin-3，Gal-3）[2]。新近研究發(fā)現(xiàn)[3]，高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠血液中Gal-3的含量異常升高。Gal-3直接作用于胰島素的三大靶器官，抑制肌肉和脂肪組織中胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取，誘發(fā)肝臟葡萄糖的生成。究其機(jī)制，Gal-3通過(guò)C端的碳水化合物識(shí)別區(qū)域與糖基化的胰島素受體結(jié)合，降低其酪氨酸磷酸化，從而干擾胰島素信號(hào)通路，最終導(dǎo)致IR。靶向Gal-3的研究發(fā)現(xiàn)，敲除Gal-3基因和Gal-3抑制劑都能明顯改善肥胖小鼠的IR。肥胖病人血液中Gal-3水平顯著增加，同時(shí)Gal-3能誘發(fā)人類(lèi)肌細(xì)胞IR。但前期亦有研究發(fā)現(xiàn)Gal-3敲除肥胖小鼠體重、內(nèi)臟脂肪含量、快速血糖和胰島素水平以及胰島素抵抗指數(shù)等指標(biāo)均高于普通肥胖小鼠[4]。因此，肥胖機(jī)體中Gal-3水平升高或降低結(jié)論并未完全一致。體力活動(dòng)尤其是耐力運(yùn)動(dòng)能夠較好地改善肥胖機(jī)體的IR，但運(yùn)動(dòng)干預(yù)Gal-3表達(dá)的研究鮮見(jiàn)報(bào)告，運(yùn)動(dòng)能否通過(guò)改善肥胖機(jī)體的炎癥反應(yīng)，影響Gal-3的表達(dá)，從而改善肥胖機(jī)體的IR尤未可知。因此，本研究以營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探尋肥胖對(duì)機(jī)體Gal-3的影響態(tài)勢(shì)，探討耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠Gal-3表達(dá)水平的影響，為明確肥胖機(jī)體IR的發(fā)生機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，豐富體育科學(xué)領(lǐng)域運(yùn)動(dòng)改善IR的理論。

1 研究對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

6周齡雄性SD大鼠30只，SPF級(jí)，體重172.36±10.25 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXX（粵）2011-0015。大鼠分籠飼養(yǎng)，4只/籠，環(huán)境溫度22～26℃，相對(duì)濕度45%～55%，自然光照。每天定時(shí)喂食喂水，自由飲食、飲水。記錄每天的攝食量，每周1次定時(shí)稱(chēng)重。

1.2 動(dòng)物分組及干預(yù)方案

將大鼠隨機(jī)分為普通飼料喂養(yǎng)組（N組，n=8）和高脂飼料喂養(yǎng)組（HFD組，n=22）。N組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，HFD組給予高脂飼料喂養(yǎng)。飼料均購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，高脂飼料熱量比為：蛋白質(zhì)17.5%，脂肪37%，碳水化合物45.5%，熱量為4.5 kcal/g。高脂喂養(yǎng)8周后，以超過(guò)N組大鼠平均體重20%為標(biāo)準(zhǔn)[7]，HFD組滿(mǎn)足條件的大鼠為16只，從中隨機(jī)選取8只及N組大鼠，測(cè)量體重、體長(zhǎng)，計(jì)算Lee’s指數(shù)（計(jì)算公式：體重（g）1/3/體長(zhǎng)（cm）×103）；眼眶取顳淺靜脈血，京都血糖試紙測(cè)量血糖濃度；分離血清后，半自動(dòng)生化分析儀測(cè)量血脂四項(xiàng)。將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，驗(yàn)證營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠建模是否成功[5]。營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠建模成功后，隨機(jī)分成2組，安靜對(duì)照組（C組，n=8）和耐力運(yùn)動(dòng)組（E組，n=8），兩組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），繼續(xù)高脂喂養(yǎng)。E組大鼠進(jìn)行8周的中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)，具體方案：坡度為0°，20 m/min，40 min/d，5 d/w，正式運(yùn)動(dòng)前先進(jìn)行1周的適應(yīng)性訓(xùn)練，N組和C組不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)干預(yù)過(guò)程中，每周定時(shí)進(jìn)行體重、體長(zhǎng)的測(cè)量，并記錄每日攝食量，測(cè)算攝食熱量。

1.3 動(dòng)物取材及檢測(cè)

8周干預(yù)結(jié)束后，3組大鼠禁食12 h后，測(cè)量體重、體長(zhǎng)，并計(jì)算、Lee’s指數(shù)，腹腔注射10%水合氯醛（按照0.3 ml/100 g體重計(jì)算注射量），腹主動(dòng)脈取血，測(cè)量血糖，采血管室溫靜置30 min后，3000r/min，4℃離心15 min后，取上清液。采集大鼠的內(nèi)臟脂肪（腎周脂肪、附睪脂肪和腸系膜脂肪），計(jì)算內(nèi)臟脂肪百分比。ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清Gal-3、Leptin和Insulin濃度，Gal-3ELISA試劑盒購(gòu)自Thermo公司，Leptin和In?sulin的ELISA試劑盒夠自Millipore公司。GPO-PAP法測(cè)定甘油三酯，COD-PAP法測(cè)定總膽固醇，磷鎢酸鎂沉淀法測(cè)定高密度脂蛋白膽固醇，聚乙烯硫酸沉淀法測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇，胰島素抵抗指數(shù)（HOMAIR）=空腹血糖（ mIU/L） ×血清胰島素（mmol/L）/22.5。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0和Graphpad prism5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；三組比較采用單因素方差分析，方差齊性條件下，事后兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，三組大鼠攝入熱量的差異采用的是重復(fù)測(cè)量方差分析；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson直線(xiàn)相關(guān)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 營(yíng)養(yǎng)性肥胖模型的建立

2.1.1 高脂膳食和普通飼料喂養(yǎng)大鼠體重和LLeeee’ ss指數(shù)比較

8周高脂飼料喂養(yǎng)后，HFD組大鼠體重顯著高于N組（P＜0.05）；HFD組體長(zhǎng)大于N組，但差異不顯著（P＞0.05）；HFD組Lee’s指數(shù)顯著高于N組（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組體重和Lee’s比較

2.1.2 高脂膳食和普通飼料喂養(yǎng)大鼠血糖和血脂四項(xiàng)比較

8周高脂飼料喂養(yǎng)后，HFD組大鼠空腹血糖水平顯著高于N組（P＜0.05）；HFD組血清甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇濃度較N組顯著升高（P＜0.05），高密度脂蛋白膽固醇濃度顯著降低（P＜0.05）（表2）。

表2 兩組血糖和血脂四項(xiàng)比較（單位：mmol/L）

2.2 8周干預(yù)后各組大鼠血脂代謝和胰島素抵抗情況

2.2.1 8周干預(yù)后各組大鼠體重、Lee’ s指數(shù)、內(nèi)臟脂肪百分比、攝食熱量比較

如圖1所示，8周干預(yù)后，C組和E組大鼠體重顯著高于N組大鼠（P＜0.05），C組大鼠體重大于E組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組大鼠Lee’s指數(shù)比較結(jié)果為C組＞E組＞N組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組大鼠內(nèi)臟脂肪百分比顯著高于N組和E組（P＜0.05），E組高于N組但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)開(kāi)始階段3組大鼠的平均攝入能量差別不大，隨后，E組大鼠的能量攝入水平出現(xiàn)下降趨勢(shì)，3周后日均攝入總熱量E組大鼠顯著小于N組和C組（P＜0.05），5周后N組和E組大鼠的日均攝入熱量顯著低于C組（P＜0.05），干預(yù)第8周的日均攝入熱量C組＞E組＞N組（P＜0.05）。

圖1 8周干預(yù)后各組體重、Lee’s指數(shù)、內(nèi)臟脂肪百分比、攝食熱量比較

2.2.2 8周干預(yù)后大鼠血液Gal-3、Leptin濃度、IR和血脂四項(xiàng)比較

如圖2所示，8周干預(yù)后，C組大鼠血清Gal-3濃度顯著高于N組和E組（P＜0.05）；C組大鼠血清Leptin濃度顯著高于N組和E組（P＜0.05）；HOMA-IR水平C組＞N組＞E組，其中C組與E組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠血清Gal-3、Leptin濃度和HOMA-IR比較

如圖3所示，8周干預(yù)后，C組和E組大鼠甘油三酯水平顯著高于N組（P＜0.05），E組顯著低于C組（P＜0.05）；C組大鼠總膽固醇水平顯著高于N組（P＜0.05），E組與N組無(wú)顯著性差異，E組顯著低于C組（P＜0.05）；C組大鼠低密度脂蛋白膽固醇水平顯著高于N組和E組；C組高密度脂蛋白膽固醇水平最低，E組顯著高于其它兩組（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠血脂四項(xiàng)比較

2.2.3 Gal-3與體重、Leptin濃度和HOMA-IR相關(guān)性檢驗(yàn)

表3顯示，8周干預(yù)后，Gal-3濃度與體重、Leptin濃度和HOMA-IR都存在顯著正相關(guān)（P＜0.05），其中與HOMA-IR的相關(guān)系數(shù)最高，為0.74；體重與Leptin濃度和HOMA-IR呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與HOMA-IR的相關(guān)系數(shù)最高，為0.75；Leptin濃度與HOMA-IR有一定相關(guān)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 Gal-3與體重、Leptin濃度和HOMA-IR相關(guān)系數(shù)

3 討論

3.1 營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型成功建立

肥胖是由遺傳和環(huán)境共同引起的一種體內(nèi)能量代謝失衡的狀態(tài)，主要表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪的增多。過(guò)多的白色脂肪堆積，一方面使脂肪組織細(xì)胞缺氧死亡，呈現(xiàn)低度炎癥狀態(tài)，進(jìn)而促使多種炎癥因子的釋放，導(dǎo)致IR的發(fā)生；另一方面，血液中游離脂肪酸的含量升高，使機(jī)體氧化應(yīng)激增多引起IR[6]。IR是多種慢性疾病發(fā)生的高危因素，會(huì)增加糖尿病、高血壓、動(dòng)脈硬化以及多種癌癥的發(fā)生率和死亡率。目前，大鼠肥胖模型主要有自發(fā)性肥胖模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、生命早期干預(yù)形成的肥胖動(dòng)物模型和營(yíng)養(yǎng)性肥胖動(dòng)物模型，其中后者與人類(lèi)肥胖的狀態(tài)最為相似，可用于高熱量食物攝入引起的肥胖癥的研究。營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)并未統(tǒng)一，通常以高脂飼料喂養(yǎng)組體重超過(guò)基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)組體重20%為依據(jù)[7]，Lee’s指數(shù)顯著性升高，同時(shí)血液中甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇顯著升高，高密度脂蛋白膽固醇顯著降低，合并血糖顯著性升高。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)8周的高脂飼料喂養(yǎng)，70%左右的HFD組大鼠體重高于N組大鼠體重20%，且Lee’s指數(shù)有顯著性提高；另外，NFD組大鼠血糖、血清甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇均顯著高于N組大鼠，而高密度脂蛋白膽固醇顯著低于N組大鼠與多項(xiàng)高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型[8，9]結(jié)果相似，且表現(xiàn)出30%左右的肥胖抵抗[10]，符合大鼠肥胖的規(guī)律，因此可以判定營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型建立成功,可進(jìn)行進(jìn)一步的干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 高脂飲食對(duì)肥胖大鼠Gal-3表達(dá)的影響

Gal-3是半乳糖苷凝集素進(jìn)化的保守家庭一員，可作為晚期糖基化終產(chǎn)物（advancedglycation end-prod?ucts，AGEs）的受體發(fā)揮作用，與血糖、胰島素抵抗、糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。Kraut?bauer[12]等采用以高脂飼料喂養(yǎng)的肥胖小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)Gal-3在小鼠肝臟、棕色脂肪、皮下和內(nèi)臟脂肪中的含量升高。游離脂肪酸和IL-6增加了脂肪細(xì)胞中Gal-3的表達(dá)，由此可見(jiàn)，肥胖機(jī)體中的炎癥狀態(tài)是促進(jìn)Gal-3表達(dá)升高的作用因素。Jin等[13]的研究結(jié)果表明，2型糖尿病合并血管疾病患者血漿中的Gal-3水平明顯高于無(wú)并發(fā)癥的糖尿病患者，Gal-3與糖化血紅蛋白和糖尿病病程顯著相關(guān)。糖尿病患者與正常人相比血漿中的Gal-3水平顯著升高，并且Gal-3與空腹血糖、糖尿病病程有明顯相關(guān)性[14]。Yilmaz等[15]的研究證明，Gal-3水平在糖尿病組最高，其是一個(gè)有效的診斷糖尿病和糖尿病前期的生物學(xué)指標(biāo)。因此，Gal-3在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展和診斷中作用明顯，但其作用機(jī)理并未明晰。近期，Lipingping[2，3]團(tuán)隊(duì)證實(shí)，在肥胖機(jī)體低度炎癥環(huán)境下，活化的巨噬細(xì)胞分泌Gal-3增加，Gal-3可以占用結(jié)合胰島素受體，降低胰島素的功效，進(jìn)而引起IR，促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)生。而2型糖尿病高糖、高胰島素微環(huán)境可能促進(jìn)小鼠胰腺星狀細(xì)胞活化、增殖、細(xì)胞外基質(zhì)生成和Gal-3表達(dá)，在一定程度上可導(dǎo)致胰腺纖維化[16]，加重了糖尿病的發(fā)生程度。然而，Pejnovic[4]等和Arsenijevic[17]等在研究中觀(guān)察到Gal-3敲除肥胖小鼠體重、內(nèi)臟脂肪含量、快速血糖和胰島素水平以及胰島素抵抗指數(shù)和系統(tǒng)炎癥指標(biāo)均高于普通肥胖小鼠，Gal-3敲除加劇了高脂飲食引起的肥胖和糖尿病。Ohkura等[18]發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血清Gal-3與血清脂聯(lián)素水平呈正相關(guān)，但是與高靈敏的C感應(yīng)蛋白和IL-6、IL-10不相關(guān)，而血清中低Gal-3與2型糖尿病患者的胰島素抵抗有關(guān)。其與Li團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果不符。由此推測(cè)，Gal-3在機(jī)體胰島素抵抗的調(diào)節(jié)方面是否存在雙向調(diào)節(jié)機(jī)制，仍需大樣本的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，16周高脂飼料喂養(yǎng)后，C組大鼠血清Gal-3、Leptin水平顯著高于N組大鼠，HOMA-IR指數(shù)也高于N組大鼠，同時(shí)Gal-3水平與體重、Leptin濃度和HOMA-IR指數(shù)都存在顯性相關(guān)。由此可知，本實(shí)驗(yàn)中營(yíng)養(yǎng)性肥胖能夠促使大鼠血清中Gal-3水平升高和IR的發(fā)生，與Li等研究成果相似，支持肥胖導(dǎo)致Gal-3升高并與IR發(fā)生相關(guān)的論斷。

3.3 耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠Gal-3的影響

耐力運(yùn)動(dòng)可抑制脂肪組織的堆積，降低炎癥，穩(wěn)定血糖，改善骨骼肌、脂肪組織的胰島素敏感性，對(duì)代謝綜合征癥狀具有明顯的改善作用[19，20]。主要作用機(jī)制有：（1）有氧運(yùn)動(dòng)能夠增加骨骼肌的血流量及增加GLUT4和IRS-1的表達(dá)量，增強(qiáng)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，改善糖耐量[21]。（2）耐力運(yùn)動(dòng)能夠增加肌糖原的消耗和合成，激活PI3K和Ras的活性，增強(qiáng)胰島素受體酪氨酸磷酸化，促進(jìn)胞內(nèi)糖代謝。（3）耐力運(yùn)動(dòng)使肌肉組織中脂蛋白酶的活性明顯提高，促使低密度脂蛋白膽固醇降低，高密度脂蛋白膽固醇升高，促進(jìn)脂肪分解，使血糖趨于正常[19]。（4）長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)可抑制骨骼肌中促炎因子的基因表達(dá)，同時(shí)，AMPK/SIRT1/NF-κB炎癥信號(hào)通路的被抑制效應(yīng)得到緩解，進(jìn)而改善胰島素抵抗[22]。本實(shí)驗(yàn)中，8周的耐力運(yùn)動(dòng)后，高脂喂養(yǎng)的E組大鼠的體重與C組比較，差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍可見(jiàn)明顯的下降，在Lee’s指數(shù)差別不大，內(nèi)臟脂肪百分比明顯下降的情況下，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)后的大鼠體型更加修長(zhǎng)。另外，血脂四項(xiàng)中甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平顯著低于不運(yùn)動(dòng)的C組大鼠，而高密度脂蛋白膽固醇則顯著升高。耐力運(yùn)動(dòng)增加肥胖大鼠能量輸出的同時(shí)也抑制了能量的攝入水平，E組大鼠的平均熱量攝入在運(yùn)動(dòng)期間一直低于C組。由此可見(jiàn)耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠降脂減肥作用顯著。另外，E組大鼠的Leptin水平和HOMA-IR指數(shù)顯著低于C組大鼠，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中8周的耐力運(yùn)動(dòng)改變大鼠肥胖狀態(tài)的同時(shí)降低了Leptin抵抗和IR。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明耐力運(yùn)動(dòng)降低了營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠血清中Gal-3的濃度，而Gal-3可作為判別IR的標(biāo)志物之一，更說(shuō)明了耐力運(yùn)動(dòng)改善肥胖機(jī)體IR狀態(tài)的作用。Gal-3在肥胖狀態(tài)下能夠結(jié)合能量代謝旺盛細(xì)胞表面的胰島素受體，阻礙胞內(nèi)一系列相關(guān)的能量代謝信號(hào)通路，尤其是降低葡萄糖的攝取和利用[3]。另外，耐力運(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)機(jī)體能量消耗，降低脂肪的堆積，改善機(jī)體的炎癥狀態(tài)從而抑制Gal-3的生成和分泌。同時(shí)，運(yùn)動(dòng)能夠增加骨骼肌細(xì)胞等胰島素受體底物和GLUT4等表達(dá)量，進(jìn)一步提高對(duì)葡萄糖的消耗，增加耐受性，改善IR。綜上所述，耐力運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)多種途徑改善營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠的肥胖狀況，降低Gal-3表達(dá)，并可能通過(guò)Gal-3途徑改善肥胖大鼠的IR水平，豐富了耐力運(yùn)動(dòng)改善肥胖機(jī)體IR的作用途徑，為相應(yīng)的藥物治療和運(yùn)動(dòng)療法提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

4.1 高脂飼料喂養(yǎng)的肥胖大鼠血清Gal-3水平高于普通食物喂養(yǎng)大鼠。

4.2 8周的中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)是引起血清Gal-3水平降低的可能因素，有助于改善營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠的IR。