蔡?hào)|高 傅永慧 呂游 曾輝 孫旭

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第四骨科（沈陽(yáng) 110000）

近些年來，前交叉韌帶（anterior cruciate liga?ment,ACL）損傷重建術(shù)后本體感覺的恢復(fù)被廣泛重視。前交叉韌帶損傷導(dǎo)致的膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定，會(huì)引起繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎和半月板損傷，嚴(yán)重影響患者的日常生活和運(yùn)動(dòng)功能[1-3]。膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性的重建，不僅需要前交叉韌帶生物力學(xué)的重建，更依賴于術(shù)后本體感覺的恢復(fù)[4,5]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3對(duì)傳導(dǎo)本體感覺的神經(jīng)的生長(zhǎng)發(fā)育和生理功能的發(fā)揮起著重要作用[6]，且前交叉韌帶重建術(shù)后的肌腱移植物內(nèi)能夠檢測(cè)到神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3的表達(dá)[7,8]，但神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3與前交叉韌帶損傷后本體感覺恢復(fù)的關(guān)系尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建帶有人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3（human neurotrophin3,NT3）基因的重組腺病毒載體，體內(nèi)轉(zhuǎn)染給自體半腱肌肌腱移植物，使得hNT-3在肌腱移植物內(nèi)過表達(dá)，而后測(cè)量體感誘發(fā)電位（somatosensory evoked potential,SEP）、腘繩肌肌電圖（electromyography,EMG）的改變和本體感受器數(shù)目的變化，旨在探討神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3對(duì)前交叉韌帶損傷重建術(shù)后本體感覺的恢復(fù)是否有促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康的日本大耳白兔42只，雌雄不限，體重2～3.1 kg,平均2.62 kg，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.2 主要材料與儀器

重組腺病毒載體（adenovirus-mediated human neurotrophin3,Ad hNT-3）與腺病毒空載體（adenovirusmediated green fluorescent protein,Ad GFP）的構(gòu)建，腺病毒的包裝、濃縮以及滴度的測(cè)定均由上海漢恒生物科技有限公司完成，滴度1.26×1011PFU/mL。鼠抗兔S-100單克隆抗體（北京博士德生物技術(shù)有限公司），免疫組化試劑盒（福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），OCT包埋劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），石蠟切片機(jī)（Thermo，HM340E），冰凍切片機(jī)（Thermo，HM525），誘發(fā)電位儀（日本光電，MEB2200）,熒光顯微鏡（Nikon,E800），圖像采集軟件（NIS-Elements F3.0）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

42只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成A、B、C三組，每組14只。A組：?jiǎn)蝹?cè)后肢膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷重建術(shù)后，自體半腱肌肌腱移植物內(nèi)用微量注射器多點(diǎn)注射20 μl滴度1.26×1011PFU/mL的Ad hNT-3。B組：?jiǎn)蝹?cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷重建術(shù)后，自體半腱肌肌腱移植物內(nèi)用微量注射器多點(diǎn)注射20 μl Ad GFP。C組：?jiǎn)蝹?cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷重建術(shù)后，自體半腱肌肌腱移植物內(nèi)用微量注射器多點(diǎn)注射20 μl的生理鹽水。

1.3.2 動(dòng)物模型的建立

術(shù)前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食水12 h，稱量體重（kg），以3%戊巴比妥鈉溶液（1 ml/kg）耳緣靜脈注射進(jìn)行麻醉，根據(jù)觀察角膜反射是否消失，適當(dāng)增減麻醉劑量。用電動(dòng)剃毛刀剃凈術(shù)肢膝關(guān)節(jié)手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，以手術(shù)切口為中心由內(nèi)向外用碘伏進(jìn)行消毒，反復(fù)3次，鋪無菌洞巾。切開皮膚，采用髕旁內(nèi)側(cè)入路，切開髕韌帶，將髕骨外推暴露出關(guān)節(jié)腔及前交叉韌帶（圖1b），用手術(shù)刀將前交叉韌帶在脛骨和股骨止點(diǎn)處完全切斷（圖1c）。用鉆頭直徑2 mm的手工鉆取脛骨近端內(nèi)側(cè)和股骨遠(yuǎn)端外側(cè)髁的骨隧道（圖1d、e）。在脛骨結(jié)節(jié)內(nèi)上方3～4 cm處切開肌肉表面筋膜，用止血鉗分離肌肉組織，暴露分離出半腱肌肌腱。取3 cm長(zhǎng)度的半腱肌肌腱（圖1a），兩端用2-0外科縫合線縫合后牽引通過骨髓道，兩端固定于周圍骨膜和軟組織，使肌腱移植物保持適當(dāng)?shù)膹埩Γ▓D1f）。前交叉韌帶重建后，根據(jù)以上分組情況對(duì)自體半腱肌肌腱移植物進(jìn)行微量注射器多點(diǎn)注射（圖1g）。用生理鹽水配置的青霉素溶液清洗關(guān)節(jié)腔后，逐層關(guān)閉切口。術(shù)后不限制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)，每天給予20萬單位的青霉素，持續(xù)1周。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)

1.4.1 一般情況

觀察術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活狀況、飲食狀況、關(guān)節(jié)活動(dòng)情況以及傷口愈合情況；觀察各時(shí)間點(diǎn)取材時(shí)肌腱移植物兩端固定有無松解脫落。

1.4.2 綠色熒光蛋白檢測(cè)

術(shù)后48 h，分別從A、B、C三組中取2只兔，過量麻醉法處死后，取出肌腱移植物，放入4%的多聚甲醛中固定24 h，接著30%的蔗糖溶液沉底，最后放入液氮中保存?zhèn)溆?，整個(gè)過程要避光。將肌腱從液氮中取出來后，用OCT包埋劑包埋后進(jìn)行冰凍切片，厚度為7 μm。暗室內(nèi)，在熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā)下觀察綠色熒光蛋白（GFP）。

圖1 前交叉韌帶重建術(shù)

1.4.3 電生理學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

術(shù)后8、16、24周，分別從A、B、C 三組中各取4只兔子進(jìn)行麻醉，角膜反射消失后固定頭部和四肢，沿原來的手術(shù)切口進(jìn)入，打開關(guān)節(jié)腔并暴露半腱肌肌腱移植物。先確定兩眶后緣連線與前正中線的交點(diǎn)，由交點(diǎn)向后0.5 cm并旁開0.2 cm作為記錄電極點(diǎn)，并于鼻根部皮下放置皮層參考電極，后肢近端用皮下電極接地測(cè)定體感誘發(fā)電位（SEPs）。然后將記錄電極放置于腘繩肌肌腹，參考電極放置于內(nèi)踝部做肌電圖（EMG）檢查。雙極表面電極刺激肌腱移植物兩端脛骨和股骨附著點(diǎn)處，刺激強(qiáng)度 18～20 V。記錄并分析SEPs和 EMG潛伏期和波幅。

1.4.4 免疫組織化學(xué)染色和HE染色

上述電生理學(xué)指標(biāo)檢測(cè)后，以過量麻醉法處死動(dòng)物。取出半腱肌肌腱移植物，放入4%的多聚甲醛中固定24 h。經(jīng)不同濃度梯度的乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片，切片厚度4 μm。每一個(gè)標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，切片后再分別進(jìn)行HE染色和S-100抗體的免疫組化染色，來觀察組織切片的大體形態(tài)以及本體感受器的形態(tài)和數(shù)量。免疫組化大體步驟：石蠟切片脫蠟和水化后，PBS沖洗；檸檬酸鈉緩沖液組織抗原修復(fù)；阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS沖洗，滴加血清，室溫孵育；滴加鼠抗兔S-100單克隆抗體，4℃過夜；PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育10分鐘；PBS沖洗，滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10分鐘；PBS沖洗，DAB顯色；蘇木素復(fù)染，流水反藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，使用 K-S檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，使用 Bartlett檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

術(shù)后A組中1只兔不明原因死亡，給予相應(yīng)補(bǔ)充。取材時(shí)C組中1只兔肌腱移植物股骨端脫落，造模失敗，給予相應(yīng)補(bǔ)充。其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后傷口愈合良好，肢體活動(dòng)正常，取材時(shí)肌腱移植物張力良好。

2.2 熒光顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染48 h后，A、B兩組中可見大量綠色熒光蛋白表達(dá)（圖2），C組中未見熒光。

圖2 熒光顯微鏡觀察（×20）

2.3 電生理指標(biāo)檢測(cè)

A、B、C三組中體感誘發(fā)電位和肌電圖的潛伏期隨著術(shù)后恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)而縮短，波幅隨著術(shù)后恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)而延長(zhǎng)；術(shù)后8、16、24周的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，A組體感誘發(fā)電位和肌電圖的潛伏期短于B、C兩組，波幅高于B、C兩組（表1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而B、C兩組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 3組 SEPs及 EMG 潛伏期和波幅變化比較（n=4，±s）

表1 3組 SEPs及 EMG 潛伏期和波幅變化比較（n=4，±s）

注：＊P＜0.05，B、C兩組在不同的時(shí)間段與A組比較；＃P＜0.05，表示3組內(nèi)第16 w、24 w與第8 w比較。

組別A組8 w 16 w 24 w B組8 w 16 w 24 w C組8 w 16 w 24 w SEPs EMG潛伏期（ms） 波幅（μV） 潛伏期（ms） 波幅（μV）30.89±1.22 24.93±0.49＃20.69±1.01＃6.48±0.75 8.41±0.49＃12.97±1.16＃19.71±1.25 16.63±0.99＃12.86±1.28＃0.22±0.04 0.25±0.02＃0.34±0.02＃35.37±1.21＊29.09±0.59＊＃25.22±0.97＊＃3.79±0.96＊5.63±0.90＊＃8.31±1.47＊＃25.07±1.28＊21.03±1.42＊＃17.65±1.96＊＃0.12±0.02＊0.17±0.02＊＃0.23±0.02＊＃0.12±0.02＊0.18±0.02＊＃0.24±0.01＊＃34.61±1.39＊29.06±1.76＊＃25.88±0.93＊＃3.94±0.23＊5.76±0.93＊＃8.60±1.37＊＃24.80±1.61＊21.30±0.50＊＃17.47±0.46＊＃

2.4 本體感受器的數(shù)目和形態(tài)

通過對(duì)組織石蠟切片的S-100抗體免疫組織化學(xué)染色和HE染色，可見4種形態(tài)結(jié)構(gòu)的本體感受器：環(huán)層小體、魯菲尼小體、高爾基樣腱器官、游離神經(jīng)末梢（由于游離神經(jīng)末梢結(jié)構(gòu)不典型，故在國(guó)內(nèi)外研究中不用于計(jì)數(shù)，故僅在圖中用星形標(biāo)記了一部分）（圖3、圖4、圖5）。A、B、C三組中本體感受器的數(shù)目隨著術(shù)后恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；且相同的時(shí)間點(diǎn)，A組本體感受器的數(shù)目多于B、C兩組（表2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而B、C兩組本體感受器數(shù)目相比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 A組免疫組織化學(xué)染色（×40）

圖4 B組免疫組織化學(xué)染色（×40）

表2 3組本體感受器的數(shù)目比較（n=4，±s）（不包括游離神經(jīng)末梢）

表2 3組本體感受器的數(shù)目比較（n=4，±s）（不包括游離神經(jīng)末梢）

＊P＜0.05，B、C兩組在不同的時(shí)間段與A組比較；＃P＜0.05，表示3組內(nèi)第16 w、24 w與第8 w比較。

A組B組C組8 w9.25±1.165.25±0.74＊5.75±0.74＊16 w13.25±0.97＃9.5±1.00＊＃9.75±0.97＊＃24 w 18±1.10＃12.25±0.97＊＃12.5±1.34＊＃

圖5 C組免疫組織化學(xué)染色（×40）

3 討論

前交叉韌帶是維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，除了其生物力學(xué)功能外，還有本體感覺功能。當(dāng)關(guān)節(jié)受到牽拉刺激，前交叉韌帶中的機(jī)械感受器會(huì)將刺激信號(hào)通過相關(guān)神經(jīng)傳導(dǎo)通路，經(jīng)脊髓傳導(dǎo)至大腦皮質(zhì)，大腦分析處理后發(fā)出指令調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)活動(dòng)[9,10]。Freeman[11]結(jié)合之前許多學(xué)者對(duì)機(jī)械感受器的研究，用改良氯化金染色法對(duì)ACL中的機(jī)械感受器進(jìn)行了形態(tài)學(xué)分類：Ⅰ類為 Ruffini小體，呈樹狀或卵圓形，被膜較薄；Ⅱ類為 Pacinian小體，呈圓形或橢圓形，被膜較厚；Ⅲ類為Golgi樣腱器官，呈梭形，被膜較??；Ⅳ類為游離神經(jīng)末梢，無髓鞘神經(jīng)末梢，這種分類方法也是目前公認(rèn)的分類標(biāo)準(zhǔn)。近年來，有研究者用S-100抗體進(jìn)行ACL本體感受器的免疫組織化學(xué)染色，也能夠清晰地觀察到本體感受器[12,13]，此方法跟傳統(tǒng)的氯化金染色法相比，特異性和敏感性更高。本實(shí)驗(yàn)就是采用鼠抗兔S-100單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察到了自體肌腱移植物內(nèi)4種不同類型的機(jī)械感受器：環(huán)層小體、魯菲尼小體、高爾基樣腱器官、游離神經(jīng)末梢，且主要分布在肌腱移植物兩端的股骨和脛骨附著點(diǎn)處，這與Zimny[14]等發(fā)現(xiàn)的人ACL的感受器主要分布 于ACL的股骨和脛骨附著點(diǎn)處的觀點(diǎn)相一致。

由于膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)形式復(fù)雜多變 ，本體感覺測(cè)量的內(nèi)容也多種多樣，主要有主動(dòng)或被動(dòng)角度重現(xiàn)法、閾值測(cè)量法、視覺模型法、體感誘發(fā)電位和肌電圖測(cè)量法[15-17]。每種測(cè)量方法都有一定的局限性，而SEPs和EMG的測(cè)量在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。本研究中，hNT-3過表達(dá)的組別中，SEPs和EMG的潛伏期縮短，波幅升高，提示hNT-3能夠促進(jìn)ACL重建術(shù)后本體感覺的恢復(fù)。在A、B、C各組中，術(shù)后16周的SEPs和EMG的潛伏期短于術(shù)后8周但長(zhǎng)于術(shù)后24周，術(shù)后16周的SEPs和EMG的波幅高于術(shù)后8周但低于術(shù)后24周；術(shù)后16周的本體感受器數(shù)量多于術(shù)后8周但少于術(shù)后24周，這表明前交叉韌帶重建術(shù)后本體感覺的恢復(fù)有著很強(qiáng)的時(shí)間依賴性，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，本體感覺逐漸恢復(fù)。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素是一類參與神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育和損傷修復(fù)的蛋白質(zhì)家族，其功能包括促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)、突觸以及髓鞘的形成[18]。Narazaki[19]等的研究表明，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3能夠促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)，改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肢體活動(dòng)；Sterne等[20]發(fā)現(xiàn)在大鼠坐骨神經(jīng)局部應(yīng)用NT-3可促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)再生，說明NT-3對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)都發(fā)揮著重要作用。相關(guān)研究表明存在肌梭源性NT-3[21]，故外源性NT-3可能有利于建立局部微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)纖維的長(zhǎng)入和本體感受器的再生過程。腺病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，感染率高，易于培養(yǎng)和純化，且不整合宿主基因組，具有較高的安全性，這些優(yōu)點(diǎn)使以腺病毒作為載體的基因治療迅速發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導(dǎo)的hNT-3轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)ACL損傷重建術(shù)后移植物內(nèi)本體感受器的再生和本體感覺的恢復(fù)，為臨床上前交叉韌帶損傷的治療提供新的思路。

本實(shí)驗(yàn)存在的不足：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本量較少，缺乏足夠的說服力；術(shù)后觀察的時(shí)間較短，遠(yuǎn)期效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證；外源性NT-3促進(jìn)前交叉韌帶重建術(shù)后本體感受器再生的機(jī)制有待進(jìn)一步探究；本實(shí)驗(yàn)中，腺病毒體內(nèi)最佳轉(zhuǎn)染滴度有待進(jìn)一步探究；腺病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染后的具體表達(dá)時(shí)間及表達(dá)量尚不清楚。