張 鑫，王鳳仙，劉 帥，耿添霈，王元太

（1.山西杏花村汾酒廠股份有限公司,山西汾陽032205；2.山西省輕工業(yè)行業(yè)管理辦公室,山西太原030002）

20世紀(jì)60年代初和90年代末，中科院微生物研究所和貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所以及山西老陳醋集團(tuán)公司等都組織相關(guān)科研人員，分別從茅臺(tái)酒的高溫大曲，老陳醋高溫發(fā)酵的醋醅和熏醅中分離得到許多耐高溫的微生物種群，尤以高溫嗜熱芽孢桿菌和紅曲霉菌備受青睞，隨著對各種功能性微量成分的分析技術(shù)的日益進(jìn)步，許多雜環(huán)類化合物，如四甲基吡嗪等對酒、醋等食品風(fēng)味的影響，引起釀造界的廣泛關(guān)注。21世紀(jì)初，中科院成都生物研究所的莊名揚(yáng)先生最先指出，地衣芽孢桿菌等的發(fā)酵產(chǎn)物，伴隨著美拉德反應(yīng)可產(chǎn)生醬香味物質(zhì)，如今四甲基吡嗪已被國標(biāo)山西老陳醋確定為特征性微量成分，其含量可達(dá)60 μg/mL，可與茅臺(tái)酒相媲美，高溫芽孢桿菌與“三高”工藝相結(jié)合，已成為各類香型白酒提高質(zhì)量的工藝措施之一。本試驗(yàn)選用的高溫嗜熱芽孢桿菌最高生長溫度均在65℃以上，其中B4號(hào)菌為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis），B7號(hào)菌為嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophillus），以及從中科院成都生物研究所引進(jìn)的編號(hào)為1.017環(huán)狀芽孢桿菌（B.circulens），1.020地衣芽孢桿菌（B.licheniformis），1.039枯草芽孢桿菌（B.subtilis），共5株芽孢桿菌。另有3株紅曲霉菌，M1發(fā)白紅曲霉（M.albidus），M2橙色紅曲霉（M.aurantiacus），M3煙色紅曲霉（M.fuliginosus）。以上菌株擴(kuò)大培養(yǎng)的方法為單株培養(yǎng)，分別制曲，釀酒生產(chǎn)時(shí)按比例混合使用，以生產(chǎn)“綿柔型”清香型白酒為目標(biāo)，并探討其工藝改革和產(chǎn)品創(chuàng)新的可行性。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)

1.1.1 高溫嗜熱芽孢桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)的工藝流程按下列工藝流程進(jìn)行：

BPY培養(yǎng)基瓊脂斜面菌株?BPY液體試管（35℃）?三角瓶麩皮原菌（35℃）?曲盒曲種（35℃）?大房麩曲?通風(fēng)干燥至水分≤12%?備用工藝要點(diǎn)：三角瓶、曲盒、大房三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基∶麩皮∶大曲粉碎料∶稻殼∶自來水（w/w）=100∶20∶5∶65，35 ℃培養(yǎng)，備用。

1.1.2 紅曲米的擴(kuò)大培養(yǎng)工藝流程

試管斜面菌株?三角瓶大米原菌（35℃）?曲盒紅曲米（35℃）?通風(fēng)干燥?紅曲米

工藝要點(diǎn)：試管斜面菌株加1%乳酸水5～10 mL制成菌懸液，接種到三角瓶大米培養(yǎng)基，大米處理工藝為：大米加1%乳酸水浸泡8～12 h，控去水，每個(gè)500 mL三角瓶約裝生米25 g，加棉塞后以121℃蒸汽滅菌30 min，然后每個(gè)三角瓶米飯約接種菌懸液2 mL，35℃培養(yǎng)5～7 d后，轉(zhuǎn)接到大米曲盒培養(yǎng)，35℃培養(yǎng)4～5 d后，42℃通風(fēng)干燥，得到紅曲米，備用。

1.2 釀酒試驗(yàn)的工藝流程

高溫潤糝：大汽蒸糝按汾酒常規(guī)工藝進(jìn)行。

大米查配料：w/w=高粱100∶大曲20%∶高溫麩曲10%（其中B4號(hào)菌2%，B7號(hào)菌4%，1.017、1.020、1.039 3株菌的麩曲共4%），控制堆積料水分≤50%，用揚(yáng)米查機(jī)拌勻。

高溫堆積：堆積場溫度保持35℃，起始堆積溫度38℃，堆心升溫至55℃，堆積1～2 d，直至堆層表面出現(xiàn)“白頭”。

高溫發(fā)酵：地缸入缸溫度≥38℃，試驗(yàn)發(fā)酵周期40 d。

蒸餾：成品酒接酒酒精度56%vol。

二米查發(fā)酵：因大米查酒醅酸度過高，成為不發(fā)酵的死醅，按正常加曲后入不銹鋼窖池，發(fā)酵期為28 d，出池酒醅的香味成分用超臨界萃取法萃取，以探索雜環(huán)類化合物等特征性微量成分的種類和含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)酒品評

酒樣編號(hào)進(jìn)行暗評，品評者為4位具有國家級(jí)評酒資格，2位有資深的評酒和釀酒工作經(jīng)歷，有較好的公正性和可信度。結(jié)果見表1。

2.2 試驗(yàn)酒的常規(guī)理化分析

試驗(yàn)酒為高酸高酯酒，衛(wèi)生指標(biāo)符合企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)于國標(biāo)GB 2757的相關(guān)規(guī)定，見表2。

3 結(jié)論

3.1 試驗(yàn)酒的總體評價(jià)

色澤：無色、清亮透明，外觀著色較深、稍掛杯。

香氣：清香復(fù)合，有醬感，微酸雜，或略有酸雜異香。

口味：綿長柔和，后口略有酸雜異味。

風(fēng)格：酒體有特色，與現(xiàn)產(chǎn)汾酒對比有較大差距，是清香型酒，但不是汾酒。

以上評語由試驗(yàn)組整理，獲得汾酒集團(tuán)質(zhì)量檢測中心主任、國家級(jí)著名評酒專家王鳳仙首席大師認(rèn)可。

“有醬感”：采用高溫嗜熱芽孢桿菌與“三高”工藝相結(jié)合，生產(chǎn)的試驗(yàn)酒有醬感，說明含有醬香特征的微量成分，盡管該成分目前尚不能定性，但可知主要來自耐高溫嗜熱芽孢桿菌，試驗(yàn)用量最大的麩曲是用嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophillus）制作的。所謂聞香和口味有醬感，與“綿柔型”是互為表里的。試驗(yàn)酒2號(hào)比1號(hào)好，說明陶缸比不銹缸發(fā)酵好。

表1 試驗(yàn)酒樣的品評意見

表2 試驗(yàn)酒常規(guī)理化分析結(jié)果

“高酸酯”：經(jīng)常規(guī)分析，試驗(yàn)酒的總酸≥3 g/L，總酯≥8 g/L，屬高酸高酯酒，成品酒的酸酯主要來自發(fā)酵酒醅，能在酒醅中產(chǎn)酸的微生物種群，主要有乳酸菌，其主要產(chǎn)乳酸；另類的產(chǎn)酸菌主要有芽孢桿菌，該菌從高溫醋醅中分離出來，主要產(chǎn)醋酸及其他多種有機(jī)酸。酸的種類和含量在很大程度上決定成品酒和老陳醋的口感綿長柔和的特點(diǎn)，在上述產(chǎn)酸微生物形成的“三高”酒醅中，紅曲霉菌參與發(fā)酵，從紅曲霉的生態(tài)特性可知，紅曲霉耐高酸，嗜乳酸、耐乙醇、耐高滲透壓（耐高糖），能在酒醅和醋醅的高溫、高酸條件下生長繁殖和發(fā)酵，加上紅曲霉微產(chǎn)酒精，產(chǎn)多種有機(jī)酸、維生素和色素，并有特強(qiáng)的酯化能力，賦予各種紅曲食品的獨(dú)特風(fēng)味。多品種高含量的有機(jī)酸，為“綿柔型”口感奠定了基礎(chǔ)，在山西老陳醋的口感上或可定義為酸味柔和，食而綿酸；在白酒口感上或可定義為綿長柔和。

“清香復(fù)合”在“三高”工藝中有一種功能性微生物，即東方伊薩酵母（Issachenkia orientalis），是在本次試驗(yàn)中高溫堆積在醅料表層出現(xiàn)的“白頭”，“白頭”具有濃烈的青蘋果香氣，江南大學(xué)教授徐巖認(rèn)為，該菌發(fā)酵產(chǎn)生的萜烯類化合物對汾酒的清香風(fēng)格有較大貢獻(xiàn)。該菌產(chǎn)酒精，合成酯能力強(qiáng)，可與異形漢遜酵母相等同，王元太認(rèn)為，伊薩“白頭”的清香風(fēng)格特征與異形漢遜酵母（Hansenala anomala）形成的“白頭”的清香有所區(qū)別，前者以清香為主，偏重蘋果香氣；后者以甜香為主，偏重于香蕉氣味，兩者比較，以東方伊薩“白頭”形成的清香更加典雅，與試驗(yàn)酒的“清香復(fù)合”有關(guān)，也是試驗(yàn)酒高酯的原因之一。

3.2 試驗(yàn)存在的問題及其工藝改進(jìn)意見

試驗(yàn)酒有酸雜異味，其主要原因是酒醅酸度過大、大米查流酒少、二米查成為不發(fā)酵的死醅，在今后的試驗(yàn)中要注意防酸、控酸，減少用曲量，降低堆積升溫，縮短堆積時(shí)間，并可相應(yīng)提高出酒率。為提高現(xiàn)產(chǎn)汾酒的清香風(fēng)格，可制造東方伊薩酵母的固態(tài)麩曲酵母，在入缸前與發(fā)酵酒醅一起高溫晾堂堆積發(fā)酵1 d，成品酒可突出清香風(fēng)格；為不影響試驗(yàn)酒的出酒率，用二米查酒醅試驗(yàn)效果更好。

試驗(yàn)酒的微量成分和功能性微量成分，如雜環(huán)類化合物、萜烯類化合物等的分析檢測應(yīng)進(jìn)一步完善分析。

本試驗(yàn)僅是一次性探討，分離鑒定的5株高溫嗜熱芽孢桿菌只試驗(yàn)了2株，高溫放線菌尚為空白，強(qiáng)化高溫大曲尚未進(jìn)行，有待后續(xù)研究。