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        健脾消癌方對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞周期、凋亡及Wnt/β—catenin信號(hào)通路相關(guān)因子的影響

        2018-09-03 10:45:54楊曉唐蔚蔣益蘭
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞凋亡大腸癌細(xì)胞周期

        楊曉 唐蔚 蔣益蘭

        摘要:目的 觀察健脾消癌方對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子及人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞周期、凋亡的影響,探討其抗大腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。方法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞分為空白組、生理鹽水組、5-Fu組及健脾消癌方低、中、高劑量組,分別干預(yù)48 h,收集細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡,Western blot檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá),PCR檢測(cè)c-myc、cyclinD1 mRNA表達(dá)。結(jié)果 與空白組及生理鹽水組比較,健脾消癌方各劑量組HCT116細(xì)胞凋亡比例、G1期細(xì)胞比例增加,S期細(xì)胞比例降低,且其細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)降低,c-myc、cyclinD1 mRNA表達(dá)降低,尤以健脾消癌方高劑量組明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論 健脾消癌方可促進(jìn)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡并將其細(xì)胞周期阻滯,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

        關(guān)鍵詞:健脾消癌方;大腸癌;Wnt/β-catenin信號(hào)通路;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞周期

        DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.015

        中圖分類號(hào):R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1005-5304(2018)06-0061-05

        Effects of Jianpi Xiaoai Prescription on Cell Cycle and Apoptosis of Human Colon Cancer HCT116 Cells and Wnt/β-catenin Signaling Pathway Related Proteins

        YANG Xiao1, TANG Wei2, JIANG Yi-lan2, TAO Zi-hao1, LIU Ke1, SONG Cheng3

        1. Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China;

        2. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha 410006, China;

        3. Hunan Cancer Hospital, The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine,

        Central South University, Changsha 410006, China

        Abstract: Objective To study the effects of Jianpi Xiaoai Prescription on cell cycle and apoptosis of human colon cancer HCT116 cells and related factors of Wnt/β-catenin signaling pathway; To investigate its mechanisms of anti-metastasis and recurrence of colorectal cancer. Methods The logarithmic growth phase HCT116 cells were divided into blank group, saline group, 5-Fu group, and Jianpi Xiaoai Prescription low-, medium-, and high-dose groups. After intervention for 48 h, the cells were harvested, and the cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The protein expression of β-catenin in the nucleus was detected by Western blot, and the expression of c-myc and cyclinD1 mRNA was detected by PCR. Results Compared with the blank group and saline group, the ratio of HCT116 cells apoptosis of Jianpi Xiaoai Prescription low-, medium-, and high-dose groups increased; the proportion of cells in phase G1 increased and the proportion of S cells decreased; the expression of β-catenin protein in the nucleus and the expression of c-myc, cyclinD1 mRNA decreased, especially in the Jianpi Xiaoai Prescription high-dose group, with statistical significance (P<0.05, P<0.01). Conclusion Jianpi Xiaoai Prescription can promote apoptosis of human colon cancer HCT116 cells and block the cell cycle, and its mechanism may be related to regulating Wnt/β-catenin signaling pathway.

        Keywords: Jianpi Xiaoai Prescription; colorectal cancer; Wnt/β-catenin signaling pathway; apoptosis; cell cycle

        大腸癌(colorectal cancer,CRC)指發(fā)生于結(jié)腸及直腸的惡性腫瘤。近年來(lái),隨著生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變,我國(guó)CRC發(fā)病率急劇上升。目前,CRC的治療仍以外科手術(shù)為主,輔以化學(xué)藥物、放射、靶向藥物等治療,術(shù)后5年生存率約50%。近年來(lái),本課題組運(yùn)用中藥復(fù)方健脾消癌方治療結(jié)直腸癌患者已達(dá)1萬(wàn)余人次,臨床療效較好[1-3],但其作用機(jī)理尚不明確。研究表明,Wnt信號(hào)通路可通過(guò)影響細(xì)胞凋亡、增殖和分化等生命活動(dòng)參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[4],大約90%結(jié)直腸癌患者存在Wnt信號(hào)通路的異常[5]。本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究健脾消癌方對(duì)CRC細(xì)胞凋亡及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子的影響,探討其抗CRC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 動(dòng)物

        SPF級(jí)雄性健康Wistar大鼠15只,4~6周齡,體質(zhì)量(300±20)g,長(zhǎng)沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(湘)2016-0002,飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物房,溫濕度適宜,人工12 h晝/夜循環(huán)照明,灌胃前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

        1.2 細(xì)胞

        人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞,上海生物醫(yī)學(xué)工程研究所。

        1.3 藥物

        健脾消癌方(人參10 g,白術(shù)10 g,法半夏10 g,靈芝10 g,黃芪20 g,茯苓15 g,薏苡仁30 g,淫羊藿10 g,莪術(shù)10 g,白花蛇舌草30 g,半枝蓮30 g,蚤休10 g,麩炒枳殼8 g,郁金15 g,甘草6 g),飲片購(gòu)自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院門診中藥房。將上藥加入10倍量水浸泡1 h,煎制1 h,過(guò)濾,將濾液儲(chǔ)存,再加入8倍量水,煎煮1 h,過(guò)濾,合并2次濾液,濃縮至3 g原藥材/mL,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?-氟尿嘧啶(5-Fu),0.25 g/支,北京紫竹藥業(yè)有限公司,批號(hào)01646346Y。

        1.4 主要試劑與儀器

        DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),PBS緩沖液(杭州四季青),胎牛血清(FBS,杭州四季青),乙醇(上海化學(xué)試劑有限公司),胰酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),Tris(美國(guó)Sigma公司),SDS(美國(guó)Sigma公司),TEMED(美國(guó)Sigma公司),Tween-20(美國(guó)Sigma公司),RIPA裂解液(北京普利萊),蛋白酶抑制劑(德國(guó)Merck公司),兔β-catenin一抗(美國(guó)Proteintech公司),顯影液(中國(guó)Well Biology公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司),Trizol(美國(guó)Invitrogen公司),引物(上海生工生物有限公司)。臺(tái)式冷凍離心機(jī)(深圳黑馬TGL-18R),超凈工作臺(tái)(法國(guó)Jouan MSC12),搖床(江蘇其林貝爾TS-92),電泳儀(美國(guó)Bio rad公司,164-5050),電泳槽(北京六一儀器廠,DYCZ-24EN),轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠,DYCZ-40A),熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo公司,SPL0960),流式細(xì)胞儀(美國(guó)Bio-rad公司),高壓消毒鍋(長(zhǎng)沙厚益深泰醫(yī)藥科技有限公司),電熱干烤箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 藥物血清制備

        參照文獻(xiàn)[6]方法制備健脾消癌方藥物血清及生理鹽水對(duì)照血清。藥物血清組大鼠給藥量按人與大鼠等效劑量換算為10 g/kg,健脾消癌方高、中、低劑量組大鼠分別給予20、10、2.5 g原藥材/(kg·d)健脾消癌藥液灌胃,生理鹽水組大鼠給予15 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃,每日1次,灌胃前空腹12 h,連續(xù)15 d,于第15日最后1次灌胃后30 min,腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉,腹主動(dòng)脈采血,3000 r/min離心30 min,吸取上清液即血清,合并同組血清,56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體,用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后,無(wú)菌試管分裝并標(biāo)記類別及日期,置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

        人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞,用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%~90%時(shí)予以胰蛋白酶消化、傳代,約2 d傳代1次。

        2.3 分組及給藥

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,調(diào)整濃度為1.5×105個(gè)/mL,取6孔板2塊,每孔加入上述細(xì)胞懸液2 mL,分別設(shè)為空白組、生理鹽水組、5-Fu組和健脾消癌方低、中、高劑量組,每組2孔。細(xì)胞鋪板完成后靜置12 h,換成含藥培養(yǎng)液。空白組:5%FBS+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基;生理鹽水組:5%生理鹽水對(duì)照血清+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基;5-Fu組:1 μg/mL 5-Fu+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基;健脾消癌方低劑量組:5%低濃度藥物血清+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基;健脾消癌方中劑量組:5%中濃度藥物血清+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基;健脾消癌方高劑量組:5%高濃度藥物血清+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基。放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

        2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡

        各組細(xì)胞給藥培養(yǎng)48 h后用不含EDTA的胰酶消化收集,PBS懸浮,2000 r/min離心5 min,洗滌細(xì)胞2次,收集約1×105~5×105個(gè)細(xì)胞,加500 μL Binding buffer懸浮細(xì)胞,再加5 μL Annexin V-FITC混勻后,加5 μL Propidium iodide,混勻,室溫避光,反應(yīng)5~15 min。1 h內(nèi)于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡情況。

        2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)

        收集細(xì)胞,用冰預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞,3000 r/min離心2 min,棄上清液。加300 μL CER試劑,反復(fù)吹打混勻,冰上裂解15 min,4 ℃、800 r/min離心5 min,棄上清液,加300 μL NER,重懸沉淀,4 ℃、4000 r/min離心5 min,棄上清,再次冰上裂解15 min,4 ℃、800 r/min離心5 min,棄上清液,加50~80 μL Suspension Buffer重懸沉淀,得核蛋白。經(jīng)電泳及轉(zhuǎn)膜后加入含5 g/100 mL脫脂奶粉的TBST,封閉60 min,加入β-catenin一抗(稀釋比例1∶200),4 ℃過(guò)夜,TBS-T洗3次后將稀釋的二抗(HRP標(biāo)記,稀釋比例1∶4000)與膜共同孵育45~60 min。TBS-T洗3次后,采用化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影。

        2.6 PCR檢測(cè)細(xì)胞c-myc、cyclinD1 mRNA表達(dá)

        收集細(xì)胞,Trizol提取各組細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度,以組織總mRNA為模板,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL:3 μL RNA,2 μL Random primer,5 μL無(wú)菌DEPC處理水,70 ℃加熱5 min,迅速插入碎冰中冷卻,再依次加入4 μL 5×Reaction buffer、4 μL dNTP、1 μL RNase inhibitor,37 ℃加熱5 min,再加入1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶,42 ℃放置1.5 h,轉(zhuǎn)72 ℃反應(yīng)10 min,得cDNA。SYBR法檢測(cè)基因表達(dá):實(shí)時(shí)定量PCR(每個(gè)樣本每個(gè)指標(biāo)3個(gè)孔,共30 μL體系,每孔9 μL)。體系組成:Template 2 μL,Primer F(10 μmol/L)0.5 μL,Primer R(10 μmol/L)0.5 μL,PCR H2O 12 μL,2×SYBR Green PCR Master Mix 15 ?L。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s,59 ℃ 50 s,共40個(gè)循環(huán)。在NCBI上搜索目的基因序列,運(yùn)用primer5軟件設(shè)計(jì)引物,由上海生工合成引物。引物序列見表1。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性時(shí),組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較用方差分析,多重比較用LSD法;數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊時(shí),用非參數(shù)檢驗(yàn)中多個(gè)獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis H檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,組間比較用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        4 結(jié)果

        4.1 健脾消癌方藥物血清對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響

        與空白組、生理鹽水組比較,健脾消癌方藥物血清干預(yù)后,HCT116細(xì)胞凋亡比例增加(P<0.01),且呈劑量依賴性。結(jié)果見表2、圖1。

        4.2 健脾消癌方藥物血清對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響

        與空白組、生理鹽水組比較,健脾消癌方藥物血清干預(yù)后,HCT116細(xì)胞G1期細(xì)胞比例增加、S期細(xì)胞比例降低(P<0.05,P<0.01),且呈劑量依賴性。結(jié)果見表3。

        4.3 健脾消癌方藥物血清對(duì)HCT116細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)的影響

        與空白組、生理鹽水組比較,健脾消癌方中、高劑量組HCT116細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低,尤以健脾消癌方高劑量組明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表4、圖2。

        4.4 健脾消癌方藥物血清對(duì)HCT116細(xì)胞c-myc、cyclinD1 mRNA表達(dá)的影響

        與空白組、生理鹽水組比較,健脾消癌方中、高劑量組c-myc mRNA表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),健脾消癌方高劑量組cyclinD1 mRNA表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表5。

        5 討論

        本課題組經(jīng)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐,認(rèn)為虛、毒、瘀并存是結(jié)直腸癌的基本病機(jī)特點(diǎn),并以“健脾益氣,化瘀解毒”為法創(chuàng)制了防治CRC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的經(jīng)驗(yàn)方健脾消癌方。該方由人參、白術(shù)、靈芝、黃芪、茯苓、薏苡仁等組成,寒溫并用,攻補(bǔ)兼施,共奏健脾益氣、化瘀解毒之功。

        Wnt信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)有2條通路,即經(jīng)典Wnt/β-catenin通路和非經(jīng)典Wnt/β-catenin通路。β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的核心元件,在該信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用。Wnt蛋白通過(guò)影響由結(jié)直腸腺瘤性息肉蛋白等組成的降解復(fù)合物的磷酸化作用調(diào)控胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的濃度變化,參與Wnt信號(hào)通路的激活。

        Wnt/β-catenin下游靶基因眾多,至今已發(fā)現(xiàn)的就達(dá)30多種,其中包括細(xì)胞周期相關(guān)基因cyclin,原癌基因c-myc、Survivin等。而細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的異常以及原癌基因c-myc的表達(dá),可促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度增殖,抑制細(xì)胞凋亡[7]。

        凋亡是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的生理性調(diào)節(jié)過(guò)程。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡進(jìn)程受阻有著密切聯(lián)系[8]。因此,可通過(guò)觀察藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響,研究藥物的潛在抗腫瘤機(jī)制。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組及生理鹽水組比較,健脾消癌方各劑量組HCT116細(xì)胞凋亡比例增加、G1期細(xì)胞比例增加,S期細(xì)胞比例降低,且其細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)降低,c-myc、cyclinD1 mRNA表達(dá)降低。提示健脾消癌方可促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡,且可將細(xì)胞阻滯于G1期,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

        參考文獻(xiàn):

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        (收稿日期:2017-11-03)

        (修回日期:2017-12-10;編輯:華強(qiáng))

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